Дослідження реактивності імуноглобулінів. Метод спін-мічених гаптенов

Хсіао і Літтл (Hsia, Little, 1973) досліджували взаємодію двох спін-мічених гаптенов - ДНФ-гідразонового похідного N-1-оксиду-2,2,5,5-тетраметил-3-пірролідона (I) і М-1 (оксиди-2,2,5,5-тетраметил-3-метіламінопірролідініл) 2 , 4-динітробензолу (II) з двома місломнимі IgA - МОРС 315 і 460 як методом ЕПР, так і по зменшенню квантового виходу флуоресценції білка.

Виявлено, що при зв`язуванні гаптенов I і II білком МОРС 315 N-О-групи в обох випадках знаходяться в сильно иммобилизировать стані, але в спектрі ЕПР з`єднання II на відміну від спектра сполуки I спостерігаються два типи іммобілізованих компонент. При зв`язуванні з білком МОРС 460 свобода обертання N-О-групи з`єднання I також значно обмежена, в той час як на обертання N-О-групи з`єднання II зв`язування з цим білком впливає мало.

Однак, судячи з близькому зменшення квантового виходу флуоресценції білків при зв`язуванні спін-мічених гаптенов і за результатами дослідження термодинаміки цього процесу, спорідненість з`єднань I і II до білків МОРС 315 і 460 різниться незначно. Отже, ступінь іммобілізації N-О-групи спін-міченого гаптена не у всіх випадках характеризує міцність комплексу.

На думку авторів, відмінності в іммобілізації з`єднань I і II можуть бути викликана двома причинами: 1) ліганди зв`язуються в різних ділянках конформационно жорсткого активного центру, 2) конформація активного центру може стабілізуватися в тій чи іншій мірі в залежності від відмінностей в структурі лігандів.

В інший роботі досліджувалися причини, що викликають появу двох типів іммобілізованих компонент в спектрі ЕПР комплексу II з білком МОРС 315. Було показано, що воно обумовлено двома енантомернимі формами спін-міченого гаптена II. Група N-О однієї з форм лиганда при цьому потрапляє в менш гидрофобное микроокружение, а другий - в більш гидрофобное, що обумовлює різне становище іммобілізованих компонент на осі напруженості магнітного поля. Зв`язування розділених енантомерних форм (спін-мічених амінів - ДНФ) білком МОРС 315 (призводило до появи тільки одного типу компонент.

Метод спін-мічених гаптенов

Заміщення спін-мічених гаптенов в активних центрах антитіл гомологічними гаптена ми було використано Леута і співробітниками (Leute е. а., 1972) для визначення концентрації морфіну в досліджуваному розчині. У цьому методі використовувався ефект сильного збільшення висоти ліній спектра ЕПР спін-міченого морфіну при його переході з иммобилизованного стану у вільний в результаті витіснення з активного центру. Висота вузьких ліній розгальмованої спектра ЕПР характеризує в даному випадку концентрацію морфіну в досліджуваному розчині.

Нижня межа чутливості такого методу-10 7М морфіну (0,03 мкг / мл). Надалі цей підхід отримав розвиток (Montgomery е. А., 1975) і був застосований для визначення концентрації ряду лікарських речовин в сироватці. Він виявився в 100 (разів чутливіші звичайного хімічного методу і мав високу специфічність. Для одного визначення достатньо 50 мкл сироватки.

Хсіао і співробітники використовували комплекс ДНФ - метилен (N-1-оксиду-2,2,5,5, -тетраметіл-3-метил, амінопірролідініл-2,4-динітробензол) з мієломний імуноглобуліном А (МОРС 315) як модельну систему для дослідження перехресної активності цього білка по відношенню до ДПФ і його аналогам. Про кількість вільного, витісненого з активних центрів спін-міченого гаптена судили за інтенсивністю високополиюй компоненти спектра ЕПР. Кількісні оцінки, отримані цим методом, знаходяться в хорошому відповідно до результатів рівноважного діалізу. Запропонований метод є досить перспективним в імунохімічних дослідженнях.
На підставі отриманих даних можна зробити наступні висновки про будову активного центру антитіл.