Метод поляризації флюоресценції антитіл. Кореляція імуноглобулінів

Для вирішення питання про існування незалежного обертання субодиниць імуноглобулінів велику допомогу надав метод поляризації флуоресценції. Основний підхід, який використовувався в цих дослідах по вивченню гнучкості імуноглобулінів, полягав в порівнянні експериментально визначається часу кореляції молекули імуноглобуліну, що характеризує знайдене в досвіді час виходу молекули з площини поляризованого світла, з часом кореляції, розрахованим виходячи з припущення про жорсткість молекули.

Так, якщо вважати молекулу IgG жорстким еліпсоїдом обертання з співвідношенням осей 1: 2 і молекулярною вагою 150 000, час кореляції цієї молекули має бути рівним 73 нсек, а експериментально спостерігається, як правило, було значно меншим: 20-40 нсек. Це вказує на здатність фрагментів до незалежного відносному переміщенню і, отже, на гнучкість зв`язують їх ділянок поліпептидних ланцюгів. Подібні дані були отримані за допомогою спінових міток.

Стаєр і Грифит (Stryer, Griffith, 1965) для визначення часу кореляції спін-міченого гаптена, пов`язаного з антитілом, вивчали поведінку речовини, що містить одночасно як флуорохромних угруповання, так і спінову мітку в розчинах різної в`язкості.

змінюючи в`язкість розчину додаванням гліцерину, домагалися збігу його спектра ЕПР зі спектром спін-міченого гаптена, пов`язаного з активним центром. Потім методом поляризації флуоресценції визначали час кореляції. Знайдене в такий спосіб час кореляції N-О-групи пов`язаного спін-міченого гаптена дорівнювала 12 нсек. При цьому автори справедливо відзначають, що це значення може бути занижена в порівнянні з часом кореляції Fab-фрагмента, так як не можна виключити можливість обертання імміноксілиюго кільця щодо дінітрофенільной групи, жорстко пов`язаної з активним центром. Цей недолік є загальним для всіх спроб визначити час кореляції Fab-фрагмента IgG, використовуючи спін-мічений гаптен.

дослідження антитіл"gt;

Хсіао і Піетт (Hsia, Piette, 1969) для визначення часу кореляції пов`язаного з активним центром спін-міченого гаптена будували калібрувальну залежність спектрів ЕПР від в`язкості розчину спінової мітки. Час кореляції, що відповідає тому чи іншому спектру, визначали за законом Стокса - Ейнштейна, вважаючи, що ефективний радіус Стокса мітки дорівнює 5 А. Найкоротший спін-мічений гаптен, найбільш жорстко пов`язаний з активним центром, мав час кореляції 39 нсек.

Двек і співавтори (Dwek е. а., 1975а) розрахували час кореляції спін-міченого ДНФ, локалізованого в активних центрах IgA (МОРС 315) і його Fab- і Fv-фрагмснтов. Воно виявилося рівним 44,4, 23 і 6,5 нсек відповідно.

отримано кролячі антитіла безпосередньо проти спінової мітки 2,2,6,6-тетраметілпіперідін-4-аміно (N-діхлортріазіна), що служила при імунізації гаптеном. Результатом утворення специфічних комплексів антитіл, їх пепсіновое і папаннових фрагментів зі спінової міткою була її сильна іммобілізація. Змішування відповідних кількостей розчинів неспецифічних кролячих IgG і мітки в аналогічних умовах приводило лише до появи спектру ЕПР вільної мітки. Час кореляції міток розраховували по Шімшіку і Мак-Коннелі (Shimshick, McConnell, 1972). Для комплексів спінової мітки з антитілами, Fc- і Fab-фрагментами в області ізоелектричної точки (рН 6,3) воно виявилося рівним 32, 30 і 18 нсек відповідно.
Отримані нами значення часу кореляції для IgG і Fab-фрагментів підтверджуються в згаданій роботі.

Відмінності в часі кореляції, отримані для Fab-фратмента, як ізольованого, так і входить до складу F (ab) 2 і інтактного антитіла вказують на обмеження свободи обертання Fab-фрагментів, що накладаються взаємодією субодиниць F (ab) 2 і IgG. Підвищення температури призводило до зменшення зведеного до стандартних умов (3 * 105 П / ° С) часу кореляції комплексів мітки з F (ab) 2 і IgG.

Мабуть, при нагріванні свобода щодо переміщення їх субодиниць зростає. Можливість отримання антитіл до спінової мітці, що служила при імунізації гаптеном, підтверджена в іншій роботі (Humphries, McConnell, 1976).


Поділитися в соц мережах:

Cхоже