Використання лейцину, фенілаланіну для оцінки метаболізму білків

Внутрішньовеннаінфузія протягом 4-6 годину збагаченого L- [1¹³З] лейцину (gt; 95% ¹³С) стала методом вибору оцінки кінетики білка в організмі людини. Оскільки лейцин є незамінною амінокислотою, джерелом немічених вільного лейцину, присутнього в плазмі, може бути тільки екзогенні лейцин, потрапляє в організм з їжею або внутрішньовенно (I), або вільний лейцин, що утворюється в результаті розпаду білка (В) в організмі.
Таким чином, Ra = I + В. З іншого боку, лейцин може тільки піддатися окисленню (до СО₂ і сечовини) або включитися в синтез білка (S, або неокислювального вивільнення лейцину, NOLD).

В ході інфузії [¹³З] лейцину молекули міченого лейцину поповнюють пул вільного лейцину, повторюючи шлях молекул немічених лейцину. Завдяки окислення [¹³З] лейцину в повітрі, що видихається з`являється ¹³СО₂, а синтез білка призводить до включення [¹³З] лейцину в білки організму.

розчинення [¹³З] лейцину в природному пулі лейцину називається його збагаченням, оскільки [¹³З] лейцин вже існує в невеликих кількостях і інфузія слідового кількості просто призводить до збільшення пулу лейцину понад вихідного вмісту в організмі. У стабільному стані ¹³З-збагачення пулу вільного лейцину відображає ставлення швидкості інфузії [¹³З] лейцину (i) до Ra лейцину.

Таким чином, Ra (мкмоль / кг / хв) можна обчислити виходячи з розведення [¹³З] лейцину. Ra = i [(Ei / Ep) - 1], де Ei і Ер (ексцес, моль%) - 13С-збагачення в вводиться розчині і плазмі (відповідно) в стабільному стані, а i - швидкість слідової інфузії (мкмоль / кг / хв). Оскільки Ra = I + В, то В = Ra - I. При прийнятому умові постійних концентрації лейцину протягом всього часу проведення експерименту Ra = Rd. Шляхом збору видихається можна визначити окислення лейцину (Ох).

Показник залучення лейцину в синтез білка може бути обчислений за формулою: NOLD = Ra - Ох. Всі дані згодом можна екстраполювати на визначення абсолютної швидкості синтезу, окислення і розщеплення загального білка організму (г білка / кг / добу), оскільки відомо, що 1 г білка організму містить 610 мкмоль лейцину. Для інфузії [13С] лейцину необхідна установка двох внутрішньовенних катетерів: один (короткий) катетер зазвичай вводять в передню ліктьову вену для введення міченого [¹³З] лейцину, інший - в контрлатеральную поверхневу вену для взяття аналізів крові.

Під час інфузії ізотопу рука розташовується на підігрівається подушці для створення ефекту «артеріалізірованной венозної» крові, покликаного більш точно відображати зміни в змішаній артеріальної крові.

Деякі припущення моделі [¹³З] лейцину:
- Відсутність ізотопного ефекту
- Відсутність метаболічного ефекту вводиться міченого атома
- фракція виробленого ¹³СО₂, яка відновлюється при диханні, відома
- Відсутність «рециркулює» мічених атомів
- Результат для міченого атома (навіть в разі, коли позначений один вуглець) рівнозначний результату для всієї молекули
- Пул лейцину в плазмі відображає внутрішньоклітинний пул

Модель лейцину заснована на кількох припущеннях, більшість з яких витримали два десятиліття інтенсивних перевірок і підтвердили свою вірність. Наприклад, не викликає сумнівів, що синтез білка відбувається не в плазмі, а у внутрішньоклітинному просторі.

Справжнім попередником лейцину в синтезі білка є тРНК-пов`язаний лейцин, і оцінка накопичення ізотопу у внутрішньоклітинному просторі передбачає етичні та технічні труднощі, оскільки пов`язана із взяттям біопсії і проведенням трудомісткого процесу екстракції интактного тРНК-пов`язаного лейцину. Замість цього накопичення ізотопу оцінюють по Пулу-кетоізокапроата (KIC), кетокислот лейцину, який можна назвати сурогатним пулом для тРНК-пов`язаного лейцину.

В ході інфузії [¹³З] лейцину він миттєво трансамініруется в кетокислоту (¹³З-KIC), потрапляючи у внутрішньоклітинний простір, причому відомо, що цей KIC знаходиться у вільному рівновазі з KIC плазми. Оскільки KIC виходить тільки з лейцину і продукується тільки всередині клітин, 13С-KIC може виступати в ролі відповідного сурогатного пулу для внутрішньоклітинного лейцину. кількість ¹³C-KIC можна легко визначити. Було виявлено, що накопичення в плазмі ¹³З-КIС відбувається приблизно на 10-20% повільніше в порівнянні з накопиченням лейцину. Дослідження біопсії тканин, проведені за участю людей і застосуванням множинних мічених атомів KIC і лейцину, а також досліди на тваринах довели, що KIC є достовірним відображенням використання пулу попередників лейцину для синтезу білка. Накопичення (збагачення) ізотопу оцінюють за допомогою технології мас-спектрометрії.

IRMS використовують для визначення дуже малого накопичення (ексцес lt; 0,01 моль%) у відносно чистих газах (наприклад, накопичення ¹³З в повітрі, що видихається СО₂), В той час як газову хромато-мас-спектрометрії застосовують для визначення найбільш значних накопичень (ексцес gt; 0,1 моль%) в органічних молекулах в складних структурах (наприклад, в лейцин плазми або KIC). Нарешті, газова хромато-комбустіон-ізотопна мас-спектрометрії об`єднує здатність газової хроматографії розрізняти множинні «піки» в плазмі з можливістю IRMS визначати дуже малі накопичення. При такому підході газову хроматографію використовують для сепарації органічних молекул в складних структурах (наприклад, лейцину в плазмі), коли інформація, що цікавить молекула перетворюється "online" в чистий газ (наприклад, в СО₂ при 800 С в печі для згоряння) і в подальшому вже піддається аналізу за допомогою IRMS як газ.

Щоб оцінити окислення лейцину потрібно провести непрямої калориметрії для обліку всієї продукції СО₂ і забір проб повітря як з вентиляційного ковпака, так і з контуру видиху, якщо пацієнт знаходиться на ШВЛ, для оцінки ¹³СО₂-збагачення. Оскільки відновлення виробленого в результаті метаболічних процесів ¹³СО₂ не дорівнює за часом короткої інфузії ізотопу, для корекції неповного відновлення потрібен коригуючий фактор. Навіть в описаних в літературі випадках, коли відновлення оцінювали в 80%, в ідеалі його потрібно було визначати окремо для кожної досліджуваної популяції або клінічного випадку, тому що його значення може варіювати. Один із способів оцінки - проведення короткої (протягом 2 година) інфузії міченого бікарбонату натрію безпосередньо перед введенням міченого лейцину.

Додаткова перевага даного підходу полягає в забезпеченні оцінки СО₂ без проведення непрямої калориметрії.

Збір повітря при диханні являє собою складний процес, тому був запропонований новий дизайн досліджень. Так, оскільки окислення лейцину в кінцевому підсумку веде до непоправної втрати амінокислот, деякі дослідники оцінювали окислення [¹³З] лейцину шляхом визначення екскреції азоту сечі під час інфузії [¹³З] лейцину без взяття проб повітря.

В якості альтернативи замість міченого лейцину може бути введений мічений фенілаланін. Оскільки він є незамінною амінокислотою, його метаболізм схожий на метаболізм лейцину. Єдина відмінність - при введенні L- [ring-²Н₄] Фенілаланіну негайним продуктом його окислення є L- [ring-²H₄] Тирозин, який можна визначити в плазмі. ставлення [²Н₄] Тирозину до [²Н₅] Фенілаланіну відображає ту частину продукції тирозину, яка обумовлена окисленням фенілаланіну. Основне обмеження даного підходу полягає в необхідності комбінувати його з введенням окремого міченого атома, наприклад 13С, в молекулі тирозину для визначення Ra всього тирозину.

Незважаючи на те що сучасні методи (Наприклад, газова хромато-мас-спектрометрії) дозволяють визначати накопичення ізотопу менш ніж в 100 мкл плазми, забір крові утруднений з етичних міркувань (якщо установка катетера обумовлена тільки необхідністю проведення інфузії ізотопу, а не інтересами клінічного моніторингу). Це стало підставою для пошуку альтернативних методів. Схожі параметри були отримані при збагаченні [¹³З] лейцином плазми і сечі. Пізніше Darling і співавт. продемонстрували невелике розходження в збагаченні плазми і сечі, характерне для кількох амінокислот. Пояснити це можна значною присутністю D- [13С] амінокислот, які є забруднюючими домішками випускаються промисловістю мічених атомів.

поява цих домішок в сечі - Результат переважної екскреції D-амінокислот нирковими канальцями, тому слід переконатися в оптичної чистоті (100%) міченої амінокислоти перед початком збору сечі.

Для з`ясування регуляції кінетики білка у новонароджених при різних умовах була досліджена кінетика лейцину. Виявлено, що інсулін у дітей з ОНМТ, так само як у дорослих, пригнічує протеоліз і знижує синтез білка. Як показали дослідження недоношених дітей з респіраторним дистрес-синдромом, раннє (починаючи з першого дня життя) внутрішньовенне введення амінокислот в порівнянні з традиційною інфузією тільки глюкози призводить до поліпшення балансу білка за допомогою стимуляції його синтезу. Відповідь організму на поступове збільшення дози амінокислот був вивчений у клінічно стабільних недоношених дітей в перший тиждень життя: на відміну від протеолізу, що спостерігається у здорових доношених новонароджених, залежного від дози пригнічення, ендогенна швидкість накопичення лейцину не залежала від введення амінокислот.

Оскільки глютамин в розчинах щодо нестабільний, традиційно використовуються для парентерального харчування розчини амінокислот не містять глютамина. Крім того, глютамин може бути «умовно незамінний» в ситуаціях, пов`язаних із значним стресом, наприклад в разі дітей з ОНМТ, які отримують парентеральне харчування. Було виявлено, що введення збагачених глютамином препаратів для парентерального харчування знижує окислення лейцину і розпад білка у недоношених дітей, які перебувають на парентеральному харчуванні.