Методи лабораторної діагностики хламідійної інфекції при верхньощелепних синуситах

Відео: Оториноларинголог Поніделко С. Н. (СМ Клініка)

I. Цітоскопіческій метод виявлення хламідій

Запропоновано дві методики, які умовно можна розділити на інвазивну і неінвазивну. Сутність першої полягає в тому, що матеріалом для дослідження є вміст верхньощелепних пазух, отримане під час пункції голкою Куликівського, яке після центрифугування використовують для приготування мазків.

Друга методика полягає в наступному: після анемізації порожнини носа 0,1% розчином адреналіну і аплікаційної анестезії області середнього носового ходу розчином дикаїну 3% - 0,3 мл, за допомогою спеціальних одноразових щіточок здійснюється забір матеріалу обертовими рухами протягом 10-15 с між медіальної поверхнею середньої носової раковини і латеральної стінкою порожнини носа в області соустий навколоносових пазух. Отриманий таким чином матеріал розподіляється рівномірно на предметному склі, висушується на повітрі і фіксується в ацетоні протягом 10 хв при температурі 4-6 ° С. Готові мазки допускається зберігати до моменту дослідження протягом 2 тижнів. при температурі 2-6 ° С.

Забарвлення за Романовським-Гімза. Барвник ex tempore розлучається дистильованою водою 1:10. Предметні скла поміщаються в чашки Петрі на дерев`яні палички препаратом вниз. Простір між мазком і дном чашки заповнюється барвником. Фарбування проводиться протягом 45 хв. Потім скла ретельно промиваються в проточній воді, просушують фільтрувальним папером і диференціюються в подкисленном спирті (до 100 мл 96% -ного етанолу додається 10 крапель крижаної оцтової кислоти). Після забарвлення препарати проглядаються в світловому мікроскопі з використанням иммерсионного об`єктива (х90). При цьому цитоплазма клітин забарвлюється в блакитний колір, ядра - в фіолетово-синій, цитоплазматичні включення хламідій визначаються у вигляді темно-синіх або рожевих мікроколоній на тлі блакитний цитоплазми клітин. На стадії елементарних тілець включення хламідій забарвлюються в рожевий колір, на стадії ініціальних тілець в синій (Поніделко С. Н., 2001). Для підвищення інформативності морфологічного методу в дослідженнях проводиться підрахунок кількості нейтрофілів, лімфоцитів і макрофагів в приготованих мазках до початку лікування і в динаміці при впливі вводяться препаратів.

II. Метод прямої імунофлюоресценції

Мазки, приготовані з соскобних матеріалів, а також мазки крові фарбуються сумішшю взятих в робочих розведеннях імуноглобуліну флюоресцирующего поливалентного хламидийного і бичачого альбуміну, міченого родаміном для контрастування фону. Використовують робоче розведення сироваток 1 / 20-1 / 40. Предметні скла з досліджуваним матеріалом і нанесеним барвником поміщають у вологу камеру в термостат на 30 хв, після чого скла витягають і інтенсивно промивають в фосфатно-сольовому буфері (рН 7,2) на магнітній мішалці протягом 1 год, змінюючи буфер через 30 хв. На висушені мазки наносять 1 краплю забуферованого гліцерину (9 мл гліцерину і 1 мл фосфатно-сольового буфера), після чого вони покриваються покривним склом (Поніделко С. Н., 2001). Препарати переглядають під люмінесцентним мікроскопом «ЛЮМАМ-ІЗ». Облік результатів проводять візуально. Результати дослідження вважаються позитивними, якщо в препараті виявляються морфологічно типові для хламідій елементи, специфічно флюоресцирующие смарагдово-зеленим або жовто-зеленим кольором:
  • ретикулярні тільця хламідій (РТ) і скупчення хламідій в цитоплазмі у вигляді мікроколоній, що мають вигляд компактних, дифузно забарвлених утворень різного розміру - від 0,25 до 1,5 мкм;
  • елементарні тільця хламідій (ЕТ) - утворення, що знаходяться переважно за межами клітин, сферичної або овоидной форми, що мають чітко виражений пофарбований периферичний ободок у вигляді замкнутого кільця або півкільця розмірами 0,25-0,5 мкм;
  • міжклітинних розташовані включення - великі яскраво-зелені плями, утворені розташованими близько один від одного ЕТ.

III. серологічні методи

Кров в обсязі 2,5-3,0 мл у обстежуваних забирають натщесерце з ліктьової вени в суху центрифужную пробірку. Пробірку з кров`ю з метою кращої ретракції згустку формених елементів витримують в термостаті при 37 ° С протягом 40-45 хв. Після термостатування пробірку центрифугують 20 хв при 3000 об. / Хв, згусток «обводять», а пробірку поміщають на 1 год в холодильник, після чого, користуючись пастерівської піпеткою, сироватку відокремлюють від осаду. Сироватки доставляють в лабораторію протягом найближчих 1,5-2 ч або зберігають при температурі 4-6 ° С протягом 1-3 діб. Окремі зразки сироваток допустимо містити в морозильній камері холодильника при температурі мінус 20-40 ° С до проведення серійних досліджень протягом терміну, що не перевищувало 6 міс.

Найбільш специфічною і інформативною (90%) вважається реакція непрямої імунофлюоресценції (РНІФ). Виявлення антитіл до хламідій тільки в одній пробі сироватки навіть при показниках їх титру 1 / 8-1 / 16 може свідчити як про ймовірність поточної хламідійної інфекції, так і про наявність слідової реакції, пов`язаної з будь-яким захворюванням хламідійної етіології, перенесеним в минулому. Наростання хламідійних антитіл в титрах 1 / 64-1 / 256 і вище навіть в одній пробі сироватки при довгостроково поточних і ускладнених формах інфекції відображає граничне наростання гуморальної реакції макроорганізму і при відповідних результатах клініко-епідеміологічного аналізу, а також анамнестичних даних набуває діагностичне значення.

Непрямий метод імунофлюоресценції дозволяє проводити ідентифікацію хламідій до виду при наявності відповідних тест-об`єктів і титрування сироваток по відношенню до конкретних видів збудників, також дає можливість оцінити зміст в сироватках окремих класів імуноглобулінів при наявності комерційних флюоресцирующих Ig М, A, G. Негативні результати серологічних тестів не виключають наявності гострої або хронічної (персистуючої) хламідійної інфекції (Поніделко С. Н., 2001).

За допомогою РНІФ у хворих верхньощелепними синусити визначають титр антихламідійний антитіл в сироватці крові. Як антигенних препаратів використовуються приготовані на розграфлених предметних стеклах мазки з мікробних суспензій, зафіксовані протягом 30 хв охолодженим ацетоном. Матеріалом для мазків служать суміші суспензій з желточних мішків курячих ембріонів або з органів білих мишей, інфікованих С. trachomatis, С. pneumoniae і С. psittaci.

Такі антигенні препарати, володіючи специфічністю на рівні роду, забезпечують виявлення антихламідійний антитіл (AT) до всіх епідеміологічно значимих видів хламідій. Досліджувані сироватки в розведенні від 1: 2 до 1: 256 наносять на мазки, скла поміщають у вологу камеру і термостатируют при 37 ° С протягом 15-20 хв. Після експозиції досліджуваний матеріал змивають струменем водопровідної води, скла занурюють в батарейний стаканчик з фосфатно-сольовим буфером рН 7,2-7,4, а потім обполіскують дистильованою водою. Після підсушування при кімнатній температурі на мазки наносять взятий в робочому розведенні кролячий античеловеческий люминесцирующий імуноглобулін і, помістивши скла у вологу камеру, термостатируют при температурі 37 ° С протягом 15-20 хв. Потім фарбують суміш видаляють, скла відмивають в фосфатно-сольовому буфері рН 7,2-7,4 протягом 10 хв, споліскують дистильованою водою і висушують на повітрі.

Мікроскопію забарвлених препаратів здійснюють за допомогою люмінесцентного мікроскопа. Інтенсивність специфічної флюоресценції в препаратах оцінюють за загальноприйнятою четирехкрестовой шкалою (Поніделко С. Н., 2001):

«++++» - Яскрава флюоресценція смарагдово-зеленого кольору, навколо ЕТ чітко видно що світяться «обідки»;

«+++» - Досить яскрава флюоресценція жовто-зеленого кольору, периферичні «обідки» у ЕТ можуть виявлятися;

«++» - Слабка флюоресценція, морфологічно збудник виявляється досить чітко, але периферичні «обідки» у ЕТ ледь помітні;

«+» - Слабка флюоресценція, колір невизначений, морфологія об`єкта мікроскопії помітна погано.

За діагностично-значимий титр антихламідійний антитіл беруть максимальне розведення сироватки, що забезпечує специфічне забарвлення не менше ніж на «++». При оцінці серологічної активності сироваток щодо хламідійних антигенів за діагностично значущі приймають титри 1: 8 і вище.

IV. Метод полімеразно-ланцюгової реакції

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) була вперше описана в 1985 р і стала стандартним методом ампліфікації ДНК у багатьох молекулярно-біологічних лабораторіях. Основу методики становлять повторювані цикли направляється олигонуклеотидами синтезу ДНК, що призводять до реплікації in vitro нуклеотиднихпослідовностей мішені. В результаті ампліфікації може утворитися 1 млрд копій ДНК-мішені, які можна виявити або за допомогою електрофорезу в гелі, або методом гібридизації із специфічним зондом з наступним виявленням гібридів методом іммуноферментатівного аналізу (ІФА). ПЛР має високу видову специфічність і чутливість до 10 молекул ДНК (Поніделко С.Н., 2001).

Після забору матеріалу за вказаними вище методиками за допомогою одноразових спеціальних щіток він поміщається в стерильні пробірки ємністю 2 мл (епіндорфи) в заздалегідь приготовлений буфер (0,9% розчин натрію хлориду). Матеріал протягом 2 ч транспортується в лабораторію або після заморожування до температури мінус 18 ° С зберігається протягом тривалого часу до проведення дослідження.

Результат аналізу вважають позитивним, якщо:
  • розмір ДНК-продукту в клінічному зразку точно відповідає ДНК-продукту контрольної проби;
  • в пробі, що містить клінічний зразок і внутрішній стандарт, ідентифікується специфічний ДНК-продукт внутрішнього стандарту;
  • в пробі, що містить замість клінічного зразка воду (негативний контроль), ДНК-продуктів не виявляється.

Результат аналізу вважають негативним, якщо:
  • в пробі, що містить клінічний зразок, специфічних ДНК-продуктів не виявляється;
  • результати ПЛР в обох контрольних пробах специфічних ДНК-продуктів не виявляють.

Аналіз повторюють, якщо:
  • в пробі, що містить контрольну ДНК, специфічних ДНК-продуктів не виявляється;
  • в пробі з внутрішнім стандартом специфічних ДНК-продуктів не виявляється, а в негативному контролі виявляється специфічний ДНК-продукт.

V. Культуральний метод виділення хламідій

Виділення збудника на культурах клітин (КМ), оброблених попередньо різними антиметаболитами, є одним з кращих методів діагностики хламидиозов, так званий «золотий стандарт».

Матеріал забирають як і для прямого иммунофлюоресцентного методу (ПІФ) спеціальними стерильними щіточками. Взятий матеріал поміщається в транспортну середу. В якості транспортного середовища використовують фосфатний буфер з сахарозою, до якого перед використанням додають інактивовану нагріванням сироватку великої рогатої худоби з розрахунку 4% від загального обсягу, стрептоміцин 50 мкг / мл, амфотерицин 25 мкг / мл середовища. Доставка матеріалу в лабораторію здійснюється (в термосі з льодом) пізніше 2 год з моменту забору. Культуральні дослідження проводять з використанням культури клітин LLC + MR2 + L929 + ВНК-21С з штучно зниженою резистентністю. Забраний матеріал нашаровуються на моношари культури клітин, вирощені на покривних склі, попередньо злив ростові середу. Потім заражена клітинна культура поміщається у флакони і центрифугируется протягом 1 год при 3000 об. / Хв, що збільшує число внутрішньоклітинних включень. Після центрифугування матеріал зливають в пробірки, куди додають ізолюючу середу «Голка» (Eaglas MEM) з ціклогексамідом в концентрації 2 мкг / мл. Пробірки інкубують в термостаті при температурі 37 ° С протягом 48-72 год (час відповідає циклу розвитку хламідій), після чого покривні скла з монослоем дістають з пробірок, укладають на предметні скельця монослоем вниз в канадському бальзамі і визначають включення збудника. Перед цим проводиться фіксація і забарвлення мазків флюоресціірующімі антитілами, а результати оцінюються через 48-72 ч методом ПІФ (з використанням специфічних поліклональних і моноклональних антитіл). При отриманні негативних результатів виробляють новий посів (пасаж) матеріалу. Інфікування клітинного моношару і оцінку результатів здійснюють за стандартною методикою.

Метод діагностичного виділення хламідій в культурі клітин необхідно використовувати протягом усього періоду захворювання, за винятком періоду антибіотикотерапії, а також протягом 2-3 міс. після нього. Для контролю вилікування з метою виявлення життєздатних хламідій, які можуть здійснювати свій повний цикл розвитку, використовують даний метод через 3 міс. після закінчення лікування.

VI. Метод електронної мікроскопії

З метою діагностики персистентних форм хламідійної інфекції при верхньощелепних синуситах використовують метод електронної мікроскопії. Проводиться дослідження біопсійного матеріалу слизової оболонки порожнини носа і пазух. Для цього ділянки слизової відразу після забору фіксуються в 2,5% -му глютарового альдегіди на 0,1 молярном какоділатном буфері при рН 7,4 протягом 2-24 ч. Після 3-кратною промивання в какоділатном буфері дофіксіруются 1% розчином чотириокису осмію протягом 1,5-2 ч. Далі проводиться зневоднення препарату в спиртах висхідної концентрації по 15-20 хв і просочення смолою у вигляді суміші Епона з аралдітом. На закінчення проводиться полімеризація в термостаті протягом 3 діб. при температурі 37 і 60 ° С. Після полімеризації готують напівтонкої зрізи до 1 мк товщиною на ультратоме LKB-3 (Швеція). Забарвлення зрізів здійснюється за методикою, запропонованою С. D. Humphrey, F. Е. Pittman (1974), метиленовим синім, азуром-2 і основним фуксином для попереднього перегляду та аналізу під світловим мікроскопом (Поніделко С. Н., 2001). Одночасно проводиться фотографування за допомогою фотомікроскопа «Opton» (ФРН). Потім готують ультратонкі зрізи товщиною 3700 ангстрем, поміщають їх на мідні сітки розміром 200 МЕЖ, після цього контрастують насиченим 30% розчином етилового спирту і цитратом свинцю (по Рейнольдсу). Зрізи досліджують під електронним мікроскопом «JEM 100S» (Японія) при прискоренні напруги 80 кВ, при збільшенні х5, х10, х30, х50 тисяч разів. Для фотографій використовується плівка типу ФТ-41П (Росія).

Для діагностики хламидийного поразки навколоносових пазух необхідно використовувати спеціальний діагностичний алгоритм.

Основним принципом діагностичного пошуку є його трьохетапним.

На першому етапі проводиться скринінгове дослідження сироватки крові хворих синусити для виявлення антихламідійний антитіл, які свідчать про поточну інфекції за допомогою ІФА та РНІФ, а також верифікація хламідій за видами (С. pneumoniae, С. trachomatis, C.psittaci).

На другому етапі за допомогою ПІФ і ПЛР здійснюється діагностика хламідій безпосередньо в осередках (порожнини носа і навколоносових пазух) і лейкоцитах периферичної крові з метою встановлення генералізації інфекції.

На третьому етапі діагностики за допомогою КМ визначають антибіотикочутливість збудників.

Даний алгоритм апробовано при обстеженні 97 пацієнтів, з яких особи з хронічними верхньощелепними синусити склали 28 осіб, 39 пацієнтів були з гострими рецидивуючими верхньощелепними синусити і 30 - не страждали захворюваннями ЛОР-органів і увійшли в контрольну групу. Порівняльна інформативність різних методів лабораторної діагностики хламідійної інфекції серед обстежених даних груп представлена в таблиці.

Порівняльна інформативність різних методів лабораторної діагностики хламідійної інфекції при синуситах


методхламідійна інфекція
С. pneumoniaeС. trachomatisС. psittaciвсього
ПІФ59 (60,7%)
ПЛР35 (36%)8 (8,2%)-43 (44,3%)
КМ31 (31,9%)11 (11,3%)-42 (43,2%)
Ніф25 (25,7%)14 (14,4%)7 (7,2%)46 (47,3%)


Як видно з представлених даних, в досліджуваних матеріалах від хворих хламідії діагностовані за допомогою поліклональних группо-специфічних антихламідійний антитіл у 59 (60,7%) осіб. Однак використання інших методів діагностики дозволило провести їх повну ідентифікацію. При цьому встановлена приблизно рівна частота виявлення С. pneumoniae і С. trachomatis в матеріалах від хворих синусити (ПЛР - 44,3%, КМ - 43,2%, Ніф - 40,2%).

Таким чином, отримані результати порівняльного вивчення методів діагностики хламідійної інфекції виявили високу частоту виявлення хламідій при верхньощелепних синуситах, що дозволяє використовувати визначення «синусит хламідійної етіології» і виділити ряд клінічних особливостей, характерних для даної групи захворювань.


"Захворювання, пошкодження і пухлини щелепно-лицевої ділянки"
під ред. А.К. Іорданішвілі
Поділитися в соц мережах:

Cхоже