Основні підходи до пренатальної діагностики генних хвороб. Пряма діагностика генних аномалій.

Методи молекулярної діагностики - Продукт і основний інструмент аналізу первинної структури, тобто послідовності нуклеотидів в молекулі ДНК - основи генома (спадкового апарату) людини. Перший етап грандіозної Міжнародної наукової програми по розшифровці молекулярної структури ДНК людини був завершений в 2000 р створенням «чорнового варіанту геному людини». У цьому розділі ми обмежимося викладом лише основних принципів ДНК-методів. Більш детально з технікою молекулярних досліджень можна ознайомитися в спеціальних монографіях і посібниках.

Основу методів ДНК-діагностики, спрямованих на ідентифікацію мутацій або молекулярне маркування мутантних хромосом, становить полімеразна ланцюгова реакція синтезу ДНК (ПЛР). Історично більш ранній метод блот-гібридизації за Саузерну в даний час застосовується значно рідше, хоча і використовується для ідентифікації деяких мутацій, перш за все динамічних мутацій », що ведуть до хвороб експансії (синдром ламкої Х-хромосоми, міотоніческаядістрофія, хорея Гентингтона, ряд нейродегенеративних захворювань) , а також гемофілії а і деяких інших захворювань.

Метод ПЛР запропонований в 1983 р американським дослідником Каррі Мулліс, удостоєним при цьому відкриття Нобелівської премії в 1993 р Метод дозволяє вибірково синтезувати (ампліфікувати) in vitro відносно невеликі ділянки ДНК, довжиною від декількох десятків до декількох тисяч пар нуклеотидів, використовуючи як матрицю будь-які зразки ДНК , що містять ампліфіціруемого послідовність.

необхідною умовою для проведення ПЛР є знання нуклеотидноїпослідовності ампліфіціруемого області ДНК, так як специфічний вибір цієї ділянки здійснюють шляхом гібридизації матричної ДНК з двома штучно синтезованими праймерами - олігонуклеотидних послідовностями ДНК, зазвичай довжиною від 15 до 30 п.о., комплементарними 3`-кінців амплифицируемого ділянки на смисловий і антисмислової нитках ДНК відповідно. Відстань між праймерами визначає довжину синтезованих молекул. Детально з технікою постановки ПЛР можна ознайомитися в керівництві.

метод ПЛР став одним з основних в молекулярної діагностики спадкових хвороб. Розроблено та широко використовуються на практиці різні варіанти цього методу, що дозволяють швидко і ефективно ідентифікувати мутації, вивчати ДНК-поліморфізм, що застосовуються для молекулярного маркування мутантних хромосом.

В даний час існують два основних підходи до пренатальної діагностики, як і взагалі до діагностиці генних хвороб:
- пряма діагностика, заснована на безпосередній ідентифікації мутацій в певному гені;
- Непряма (непряма) діагностика, в основі якої лежить маркування мутантного гена (іноді звана маркуванням «хворий» хромосоми, що несе ген) за допомогою молекулярних маркерів.

Пряма діагностика генних аномалій

Основу прямий діагностики становить ідентифікація мутацій в самому гені. Переваги методу - висока (що наближається до 100%) точність діагностики, можливість проведення ПД, а також аналізу інформативності (придатності для молекулярної діагностики) сім`ї та виявлення гетерозиготних носіїв при відсутності хворої дитини.

при відсутності мажорних мутацій гена потрібен детальний молекулярний аналіз (сканування) первинної структури гена з метою виявлення мутацій, що можна віднести до недоліків методу.

В основі будь-якого моногенного захворювання лежать порушення функцій гена, викликані різними мутаціями в його змістовній частині, тобто в послідовності гена, що кодує синтез білка (кДНК). Тип і спектри мутацій, як і їх фенотипічні вираз (тяжкість захворювання) специфічні для кожного гена і в значній мірі визначаються унікальними особливостями його первинної структури (послідовністю нуклеотидів).

Відомо також, що частота різних мутацій в кожному гені різна. Існують часто зустрічаються «мажорні» мутації, діагностична цінність яких особливо висока, і «мінорні» (поодинокі спорадичні), реєструються вкрай рідко. Для багатьох генів, відповідальних за спадкові захворювання, спектри мутації добре вивчені і розроблені оптимальні алгоритми їх ідентифікації. Так, наприклад, мажорній для гена муковісцидозу є мутація delF508, яка трапляється майже в 50% всіх мутантних хромосом у хворих на муковісцидоз в Росії, для гена фенілаланінгідроксилази - це мутація R408W, виявлена У45% хворих на фенілкетонурію в Росії, для гена дистрофина характерні досить протяжні делеції, реєстровані в 60% Х-хромосом у хворих миодистрофией Дюшенна і т.д.

Більш детально алгоритми молекулярної діагностики різних моногенних хвороб наведені в спеціальних інструкціях, оглядах.