Неізотопних методи иммунохимического аналізу гормонів

Неізотопних методи иммунохимического аналізу гормонів

Ми не випадково приділили так багато уваги РІА.

Це був перший метод точного кількісного визначення гормонів, що набув широкого поширення і зіграв величезну роль в лабораторній діагностиці ендокринних порушень. Саме на базі РІА сформувалися сучасні принципи иммунохимического аналізу гормонів. Однак за останні двадцять років РІА був майже повністю витіснено із клінічної практики неізотопних методами иммунохимического аналізу - ІФА і Імунохемілюмінесцентні аналізом. В основі цих методів, так само як і в основі РІА, лежить взаємодія антигенів і антитіл, але в якості мітки використовуються не радіоактивні ізотопи, а ферменти, що каталізують реакції з утворенням забарвленого продукту, або люмінесцирующие речовини. У першому випадку на кінцевому етапі аналізу вимірюють оптичну щільність реакційної суміші, у другому - кількість квантів, що випускаються люмінесцирующим речовиною.

Відео: Регіональний лабораторно-діагностичний центр иммунохимических методів дослідження ІХМІ

імуноферментний аналіз

Для кількісного визначення гормонів найчастіше застосовують твердофазний ІФА з двома антитілами. Його проводять в многолуночних пластикових планшетах. На дні лунок сорбованих моноклональні антитіла, специфічні до певної антигенної детермінанті гормону. В лунки вносять проби сироваток з невідомими концентраціями гормону або стандартні зразки з відомими концентраціями гормону. Планшет інкубують 30-120 хв-за цей час молекули гормону встигають зв`язатися з антитілами, сорбованих на пластиці. Після інкубації лунки промивають буферним розчином для видалення незв`язаних гормону і інших компонентів сироватки. Потім в лунки вносять поліклональні антитіла до гормону, кон`юговані з пероксидазою (так званий кон`югат), і інкубують планшет 15-30 хв. При цьому молекули кон`югата зв`язуються з молекулами гормону. Лунки знову промивають для видалення незв`язаних кон`югату і додають в них розчин, що містить незабарвлений субстрат пероксидази. Пероксидаза перетворює цей субстрат в забарвлений продукт. Інтенсивність забарвлення розчинів у лунках (її вимірюють на фотометрі) прямо пропорційна кількості кон`югату в лунці, а воно - концентрації гормону. Концентрації гормону в пробах сироваток розраховують по калібрувальної кривої, побудованої за результатами вимірювань концентрацій гормонів в стандартних зразках.

Треба підкреслити, що ця методика ІФА, на відміну від описаної вище методики РІА, є неконкурентною. Справа в тому, що в реакційній суміші відсутня мічений антиген і рівень зв`язування поліклональних антитіл (кон`югату) з антигеном, сорбованих на моноклональних антитіл, залежить тільки від концентрації антигену в пробі. Неконкурентні методики застосовуються і при Імунохемілюмінесцентні аналізі.

імунохемілюмінесцентний аналіз

Існує безліч варіантів імунохемілюмінесцентного аналізу. Ми опишемо типовий варіант, який застосовується для вимірювання рівнів гонадотропних гормонів в сучасних автоаналізаторе. У цьому варіанті для зв`язування гормону використовуються парамагнітні мікрочастинки, покриті моноклональними антитілами, високоспеціфічнимі до даного гормону. Мікрочастинки суспендують в буферному розчині і додають до суспензії проби сироваток або стандартні зразки. Після короткочасної інкубації (10 20 хв) мікрочастинки з пов`язаними гормоном осаджують в магнітному полі і кілька разів промивають. Потім мікрочастинки знову суспендують в буферному розчині, і додають до суспензії поліклональні антитіла до гормону, кон`юговані з лужною фосфатазою. Після відмивання незв`язаних кон`югату до суспензії мікрочастинок додають діоксетіна фосфат. Під дією лужноїфосфатази з діоксетіна фосфату утворюється діоксетін, що випускає кванти люмінесценції. Інтенсивність люмінесценції, яку вимірюють за допомогою фотоумножителя, прямо пропорційна концентрації гормону в зразку.

Відео: Лабораторні дослідження

Методи виявлення аутоантитіл

Порушення репродуктивної функції можуть бути прямо або побічно обумовлені аутоімунними патологіями. Наприклад, чоловіче безпліддя може бути викликане аутоімунної реакцією проти сперматозоїдів, а в патогенезі жіночого безпліддя може грати роль аутоімунне захворювання щитовидної залози або надниркових залоз. Маркерами аутоімунних патологій служать аутоантитіла. Для виявлення сироваткових аутоантитіл (наприклад, антифосфоліпідних антитіл, антитіл до йодідпероксідазе або 21-гідроксилази) застосовують ІФА, імунохемілюмінесцентний аналіз і метод непрямої імунофлюоресценції. В останньому випадку в якості антигенного субстрату використовують кріостатних зрізи тканини, проти якої спрямована автоімунна реакція. Для виявлення антиспермальних антитіл в спермі і слизу застосовують метод микроагглютинации з латексними частинками, покритими антитілами до IgA або IgG.

інші методи

Для деяких гормонів, наприклад катехоламінів і серотоніну, непросто створити надійні методи иммунохимического аналізу. Справа в тому, що ці речовини мають дуже невелику молекулярну масу і проти них важко отримати високоспецифічні первинні антитіла, навіть моноклональні. Такі ж труднощі виникають і при розробці методів иммунохимического аналізу стероїдних гормонів і їх похідних (через високу ймовірність перехресних реакцій первинних антитіл з різними стероїдами, мають дуже велике антигенне схожість). Тому для точного кількісного аналізу таких речовин останнім часом все частіше застосовують рідинну хроматографію високого дозволу з подальшою мас-спектрометрією.

Нерідко ендокринні порушення, в тому числі і порушення репродуктивної функції, бувають обумовлені не патологічними змінами рівнів гонадотропних або статевих гормонів, а мутаціями їх рецепторів. Для оцінки функції рецепторів раніше застосовувалися біологічні тести in vitro: у хворого брали біопсію тканини, що є мішенню даного гормону, поміщали биоптат в культуральне середовище, додавали до середовища гормон і оцінювали реакцію тканини на цей гормон. У наші дні мутації рецепторів виявляють шляхом визначення послідовності нуклеотидів ДНК у відповідних генах. ДНК для таких аналізів зазвичай отримують з лімфоцитів хворого.


Поділитися в соц мережах:

Cхоже