Попередімплантаційна генодіагностика

Її поєднання з тестом на Анеуплоїдія дозволяє поліпшити результати ЕКО. ДНК для преимплантационной генодиагностики отримують з полярного тільця, при біопсії на стадії дроблення зиготи або при біопсії бластоцисти.

Аналіз ДНК полярного тільця проводиться на стадії ооцита II порядку. Головний недолік цього методу полягає в тому, що для того, щоб підтвердити генотип ембріона, потрібно пренатальна діагностика. Рекомбінація хромосом в 1-му розподілі мейозу може стати причиною помилкового діагнозу. У більшості центрів проводять біопсію ембріона, що дозволяє виявляти захворювання, успадковані від кожного з батьків. Матеріал для біопсії зазвичай отримують на стадії дроблення зиготи (на стадії восьми клітин), відбираючи 1-2 клітини. Через труднощі, пов`язані з проведенням діагностики на настільки обмеженому матеріалі (див. Нижче), в ідеалі краще проводити біопсію бластоцисти, оскільки вона містить до 300 клітин. Крім того, при цьому для біопсії можна брати клітини трофобласта, оскільки вони більш доступні і це не завадить належному розвитку ембріона. Однак біопсію бластоцисти проводять далеко не у всіх центрах через складнощі вирощування її клітин в культурі і зниженою виживання таких бластоцист після кріоконсервації. Проте, застосовуючи ці методи, вдається досягти вагітності, а згодом, у міру накопичення досвіду, їх ефективність напевно підвищиться.

Матеріал, отриманий при біопсії, аналізують за допомогою одного з двох методів: ПЛР або флюоресцентной гібридизації in situ. Лабораторії, які виконують такі аналізи, повинні мати відповідний сертифікат і в своєму звіті вказувати, який метод застосовувався, а також приводити розшифровку отриманих результатів. Проте фахівцям з лікування безпліддя вкрай важливо розбиратися в молекулярно-генетичних методах преимплантационной генодиагностики, області їх застосування та властивих їм недоліки.

ПЛР

ПЛР найкраще підходить для діагностики моногенних захворювань-з її допомогою визначають також стать ембріона, хоча тепер для цього частіше застосовують флюоресцентную гібридизацію in situ. Щоб виявити за допомогою ПЛР мутацію в тому чи іншому гені, необхідно ще до ЕКО знати, яку мутацію шукати, і заздалегідь підібрати умови реакції. У кожну реакцію в обов`язковому порядку включаються відповідні позитивні і негативні контролі, в іншому випадку результатами можна довіряти. Необхідно пам`ятати, що при проведенні реакції може виникнути ряд складнощів, в тому числі:

1. відсутність продукту ПЛР;
2. забруднення зразка;
3. втрата алелі.

Крім того, у багатьох центрах, якщо планується застосовувати для преимплантационной діагностики ПЛР, вдаються до інтрацитоплазматичної ін`єкції сперматозоїда, щоб уникнути можливих помилок в діагностиці, обумовлених впровадженням в прозору оболонку додаткових сперматозоїдів.

Оскільки при преимплантационной генодіагностика кількість ДНК-матриці для ПЛР мало - як правило, кілька пікограмів, в той час як зазвичай при ПЛР застосовуються сотні нанограммов, доводиться збільшувати число циклів ампліфікації. Якщо для ПЛР береться ДНК з єдиної клітини (або декількох клітин), часто потрібно 35-60 циклів, тоді як при стандартній ПЛР (коли кількість зразка не служить лімітуючим фактором) - близько 30. Іншим виходом з положення є ПЛР з вкладеними праймерами (або одним вкладеним праймером): дві послідовні реакції для цільової ампліфікації невеликих кількостей матриці. В останні роки для аналізу дуже малих кількостей ДНК використовувалися праймери з флюоресцентной міткою, що дозволило підвищити чутливість ПЛР приблизно в 1000 разів і таким чином скоротити число циклів ампліфікації.

Щоб виключити забруднення зразка, слід дуже ретельно готувати реакційну суміш і проводити реакцію- крім того, в реакцію включають негативний контроль (реакційну суміш, що містить всі компоненти, крім ДНК). Якщо в негативному контролі виявлено продукт ПЛР, ймовірно забруднення проби сторонньою ДНК - в цьому випадку результатами ПЛР в інших пробах довіряти не можна. Оскільки при використанні праймерів з флюоресцентной міткою число циклів ПЛР менше, ймовірність забруднення зразка нижче.

Втрата аллеля означає, що амплифицируют в основному один з алелів, другий же амплифицируют дуже слабко або амплифицируют зовсім. Очевидно, що це має найбільше значення при виявленні захворювань з аутосомно-домінантним типом успадкування. Якщо «втрачений» аллель містить домінантну мутацію, то помилка при аналізі може призвести до перенесення в порожнину матки ембріона, що містить мутантний ген. Щоб обійти цю проблему, можна одночасно ампліфікувати інший близько розташований фрагмент ДНК, що володіє високим ступенем поліморфізму (множинна ПЛР). Крім того, як уже згадувалося, чутливість ПЛР можна підвищити, використовуючи праймери з флюоресцентной міткою.

Асоціація по преимплантационной генодіагностика Європейської групи по репродукції людини і ембріології (ESHRE) провела оцінку діагностичної точності ПЛР і флюоресцентної гібридизації in situ. За даними за 1999-2001 рр., В 81 випадку після преимплантационной генодиагностики за допомогою ПЛР проводилася пренатальна або постнатальна діагностика-при цьому помилки в діагностиці захворювань, наследующихся за законами Менделя, виявлені в 5 випадках (6,2%). Повторна діагностика для підтвердження результатів проводилася лише в половині випадків преимплантационной діагностики. Потрібно також враховувати випадки, коли не можна було провести біопсію або неможливо поставити діагноз.

Флюоресцентная гібридизація in situ

Цей метод полягає в тому, що зонд (одноцепочечная ДНК), що несе флюоресцентную мітку, гибрідизуючою з денатурированной ДНК з метафазної пластинки, окремих клітин або тканин. У преимплантационной генодіагностика метод може застосовуватися для:

1. визначення статі ембріона при Х-зчеплених захворюваннях, якщо немає можливості провести ПЛР;
2. виявлення хромосомних транслокацій;
3. виявлення змін в числі хромосом;
4. виявлення інших хромосомних аномалій, наприклад анеуплоїдії.

При дослідженні на Анеуплоїдія можливі технічні труднощі, пов`язані з визначенням числа хромосом. Якщо для аналізу беруться окремі інтерфазна клітини, дуже важко точно визначити число сигналів (іншими словами, хромосом), коли досліджуєш одну-єдину клітину. Якщо видно тільки один сигнал, це може означати моносомія по даній хромосомі, але також і перекривання сигналів або те, що гібридизація зонда з однією з хромосом не пройшла. Точно так само наявність трьох і більше сигналів може означати трисомії, але може бути викликано технічними проблемами: двоїнням сигналу або аномальної флюоресценцией. Щоб розширити можливості діагностики, можна одночасно застосовувати хоча б три зонда: на Х-хромосому, Y-хромосому і одну з аутосом, наприклад на 18-у хромосому. При цьому лабораторія завжди повинна жорстко стежити за якістю проведення гібридизації, щоб точність діагностики була якомога вище, оскільки відомо, що при дослідженні 100 нормальних диплоїдних клітин 100 пар сигналів для кожної хромосоми отримати не вдасться. Можливості діагностики розширяться, якщо з`явиться можливість аналізувати більшу кількість клітин.

При виявленні цим методом транслокаций зазвичай застосовують зонди, фланкирующие або захоплюючі місце транслокации. Оскільки безпосередньо після отримання яйцеклітини для ЕКО полярні тільця містять конденсовані метафазні хромосоми, можна використовувати зонди для «розфарбовування» хромосом в поєднанні з зондами до центромерная ділянкам (альфа-сателітні повтори) і певним локусам. На жаль, для клітин, взятих на стадії дроблення зиготи або на стадії бластоцисти, такі зонди непридатні, оскільки хромосоми можуть не перебувати в метафазі і недостатньо конденсованих. Розроблено метод, при якому використовуються зонди до субтеломерним ділянках хромосом, специфічні для хромосом, між якими відбувається транслокація, і зонд до центромерная ділянці, проксимальному по відношенню до місця транслокации. Такі зонди дозволяють виявити в інтерфазних клітинах декомпенсовані транслокации, але не в змозі відрізнити нормальні хромосоми від хромосом з компенсованими транслокаціями.

Згідно зі звітом Асоціації по преимплантационной генодіагностика Європейської групи по репродукції людини і ембріології, флюоресцентная гібридизація in situ дала помилковий результат в 8 випадках з тих 145, коли слідом за преимплантационной діагностикою проводилася пренатальна або постнатальна (5,5%). Серед помилкових діагнозів - два випадки трисомії, одна мозаїчна трисомия, одна моносомия і по одній компенсованій і декомпенсованій транслокации. Крім того, при дослідженні на Анеуплоїдія нез`ясованої виявилася трисомія по 21-й хромосомі. Як і у випадку з ПЛР, підтвердження результатів флюоресцентної гібридизації in situ було проведено менш ніж у половини жінок, що пройшли Попередімплантаційна генодіагностика.

Роль флюоресцентной гібридизації in situ при визначенні транслокаций на сьогоднішній день не ясна, оскільки в 50-70% випадків, коли батьки є носіями компенсованих реципрокних транслокацій, при дослідженні ембріонів знаходять декомпенсовані транслокации. Наведені в літературі дані про частоту успішного настання вагітності після дослідження сильно коливаються, але за даними з трьох великих центрів частота настання вагітності в перерахунку на одне взяття яйцеклітин становить 29%. Частина авторів повідомляє, що преімплантаціона генодіагностика знижує ризик мимовільного аборта- проте неясно, чи підвищує вона частоту успішного завершення вагітності в порівнянні з природним зачаттям, оскільки більше половини ембріонів матимуть аномалії і, таким чином, швидше за все в будь-якому випадку не виживуть. Незважаючи на те що преімплантаціона генодіагностика з тестом на Анеуплоїдія вже багаторазово застосовувалася при ЕКЗ, жодне з опублікованих рандомізованих проспективних досліджень не показало значного збільшення числа благополучних результатів вагітності. ЕКО із застосуванням преимплантационной діагностики - інвазивна і дорога процедура, тому важливо точно окреслити практичну роль цього методу.

Асоціація по преимплантационной генодіагностика Європейської групи по репродукції людини і ембріології

Зробити правильні висновки з результатів преимплантационной генодиагностики, проведеної методами ПЛР і флюоресцентної гібридизації in situ, на практиці як і раніше не завжди можливо. Згідно зі звітом Асоціації по преимплантационной генодіагностика Європейської групи по репродукції людини і ембріології за 1999- 2001 рр., Проведено 1197 циклів ЕКО як показали результати подальшої пренатальної або постнатальної діагностики, преімплантаціона генодіагностика із застосуванням ПЛР дала помилковий результат в 5%, а з застосуванням флюоресцентной гібридизації in situ - в 6% випадків. Слід враховувати також, що подальшу діагностику проводили менш ніж в половині випадків, так що кількість помилкових діагнозів може бути занижена. Однак ці дані не означають, що в 94% випадків був поставлений належний діагноз. За даними Асоціації, загальна частота настання вагітності після взяття яйцеклітин становила 17%, біопсія була успішною в 97% випадків, а діагностику вдалося провести тільки в 86% випадків. В цілому це означає, що правильний діагноз при преимплантационной діагностиці був поставлений приблизно в 85% випадків. Тих, хто збирається пройти Попередімплантаційна генодіагностика, слід попередити, що в 15% випадків правильний діагноз поставити не вдається.