Виробництво вторинних метаболітів: методи культивування продуцентів антибіотиків

В сучасних умовах найбільш перспективним методом вирощування мікроорганізмів-продуцентів антибіотиків визнаний метод глибинного культивування. Метод полягає в тому, що мікроорганізм розвивається в товщі рідкої живильного середовища, через яку безперервно подається стерильне повітря, і середовище перемішується.

Існує чотири основних модифікації глибинного способу вирощування мікроорганізмів.

1. Періодичне культивування. При цьому способі весь процес розвитку мікроорганізмів повністю завершується в одному ферментаторі, після чого ферментатор звільняється від культуральної рідини, ретельно промивається, стерилізується і знову заповнюється свіжою живильним середовищем. Середа засівається досліджуваним мікроорганізмом, і процес відновлюється.

2. відокремлений метод. Культивування мікроорганізмів здійснюється в ферментаторах з періодичним відбором частини обсягу культуральної рідини в ферментаторі і доводиться свіжої живильним середовищем до вихідного рівня.

3. Батарейний спосіб. Мікроорганізми розвиваються в ряду послідовно з`єднаних ферментаторів. Культуральна рідина на певній стадії розвитку мікроорганізму перекачується з першого ферментатора в другій, потім з другого в третій і т. Д. Звільнений ферментатор негайно заповнюється свіжою живильним середовищем, засіяної мікроорганізмом. При цьому способі вирощування мікроорганізмів ємності використовуються більш раціонально.

4. Безперервне культивування. В основі методу лежить принцип безперервного протоку живильного середовища, що дозволяє підтримувати розвиток мікроорганізму на певній стадії його зростання. Стадія розвитку мікроорганізму визначається тим, що в цей період відбувається максимальний біосинтез антибіотика або іншого біологічно активного з`єднання. Встановлено, що в умовах безперервного процесу біосинтезу деяких антибіотиків можна отримати хороші результати, якщо процес вести в дві стадії. У першому апараті батареї підтримують високу швидкість потоку, що забезпечує більшу швидкість росту продуцента антибіотика, з тим, щоб отримати високоактивну біомасу, а в другому апараті - забезпечують низьку швидкість потоку і відповідно невелику швидкість росту. Процес безперервного культивування - перспективний напрямок сучасної біотехнології.

Стерилізація живильних середовищ Для кожного продуцента антибіотика розробляється оптимальна живильне середовище.

Середовище повинне відповідати певним вимогам:
а) забезпечувати максимальний вихід антибіотика;
б) складатися з відносно дешевих компонентів;
в) мати хорошу систему фільтрів здатність;
г) забезпечувати застосування найбільш економічних прийомів виділення і очищення антибіотиків.

Стерилізація живильних середовищ в промислових умовах здійснюється двома методами: періодичним і безперервним.

Періодичний метод стерилізації застосовується при використанні невеликих обсягів середовища і полягає в тому, що навколишнє середовище нагрівається до температури 120-130 С безпосередньо в ферментаторах або в спеціальних котлах-стерилізатори, витримується при цій температурі протягом 30-60 хвилин (в залежності від об`єму середовища і її складу), після чого охолоджується до 27-30 С.

За час, що витрачається на нагрів середовища до температури, необхідної для стерилізації, і її охолодження, знищується значне число мікроорганізмів. Ефект стерилізації та збереження термолабільних речовин знайдені в тому випадку, якщо стерилізацію проводять при більш високій температурі і за коротший час.
Безперервний метод стерилізації доцільно застосовувати при використанні великих обсягів середовища.

Приготована середа через спеціальної посудини за допомогою насоса подається в стерилизационную колону, через яку пропускають гостру пару (тиск пара близько 50 5 Па). Пар подають зверху по внутрішній трубі, що має щілиноподібні прорізи, завдяки чому він надходить в середу, швидко її нагріваючи. Середовище в колону подається знизу і рухається по спіралі навколо внутрішньої труби.

Понеділок, нагріта в колоні до необхідної для стерилізації температури (~ 130 С), надходить в спеціальний апарат, де вона витримується певний час при температурі 125-130 С. Час витримки залежить від складу середовища і триває 5-10 хвилин. Звідси стерильному середовищі надходить в змієвиковий холодильник, охолоджується до 30-35 С (на виході) і надходить у ферментатор.

Безперервний метод стерилізації має ряд переваг: можливість автоматичного регулювання процесу, швидкий і рівномірний нагрів середовища, забезпечення більш повної стерильності середовища та ін.

Підготовка посівного матеріалу Підготовка посівного матеріалу - одна з ответственейших операцій в циклі біотехнологічного способу отримання антибіотиків. Від кількості і якості посівного матеріалу залежить як розвиток культури в ферментаторі, так і біосинтез антибіотика. Продуцент зазвичай вирощують на багатих за складом натуральних середовищах, здатних забезпечити найвищу фізіологічну активність мікроорганізмів. Підготовка посівного матеріалу - процес багатоступінчастий (рис.5.5).


Мікроорганізм попередньо вирощують на агаризованому середовищі в пробірці (1, 2), потім з пробірки роблять висів у колби з рідким живильним середовищем і проводять дві генерації при глибинному вирощуванні на гойдалках протягом двох-трьох діб для кожної генерації (3а і 3б). З другої генерації культури в колбі роблять посів в невеликий (10 л) інокулятор 4, після чого добре розвинену культуру переносять в більший інокулятор 5 (100-500 л), звідки і роблять посів в основний ферментатор 6. Для посіву в основний ферментатор використовують від 5 до 10% посівного матеріалу (інокулята).

Розвиток продуцента антибіотика в ферментаторах розвиток мікроорганізму в ферментаторах проходить при строгому контролі всіх його стадій і дуже точному виконанні регламенту умов розвитку. Велику увагу приділяють підтримці заданої температури культивування, активної кислотності середовища (рН), ступеня аерації і швидкості роботи мішалки. У процесі розвитку організму здійснюють біологічний контроль, враховують споживання організмом основних поживних компонентів субстрату (джерела вуглецю, азоту, фосфору), уважно стежать за освітою антибіотика. Останнім часом все частіше біологічний контроль проводять за допомогою ЕОМ.

Велика увага при розвитку продуцента в ферментаторах звертають на процес піногасіння. При продуванні повітря через культуру мікроорганізму утворюється багато піни, яка істотно порушує процес розвитку продуцента антибіотика в ферментаторі. Поява великої кількості піни обумовлено білковими речовинами, що знаходяться в середовищі, і її високою в`язкістю, що пов`язано з рясним накопиченням біомаси.

Для боротьби з піною в ферментаторах використовують поверхнево-активні речовини: рослинні масла (соєве, соняшникове), тваринний жир (лярд, кашалотового жир), а іноді мінеральні масла (вазелінове, парафиновое), спирти і вищі жирні кислоти. Нерідко в якості піногасників використовують спеціально синтезовані речовини (силікони, діазобутананкарбаміл і ін.).

Багато речовин (масла, жири, спирти та ін.), Які використовуються в якості піногасників, споживаються продуцентами антибіотиків як додаткові джерела вуглецевого живлення. При цьому часто спостерігається підвищення виходу антибіотика. Однак внесення пеногасителя може знижувати швидкість розчинення кисню, що, в свою чергу, негативно позначається на розвитку мікроорганізму і його биосинтетической активності.

Іноді використовуються механічні способи пеногашения (відсмоктування піни через спеціальні труби, руйнування бульбашок піни сильними струменями рідини, пари або газу).

Загальна схема виробництва антибіотиків до стадії виділення і хімічного очищення представлена на рис. 4.6.


Попередня обробка культуральної рідини, виділення і хімічне очищення антибіотиків
У процесі розвитку мікроорганізмів утворені ними антибіотики в більшості випадків майже повністю виділяються з клітин в навколишнє середовище. Однак в ряді випадків в культуральну рідина потрапляє лише частина антибіотика, а інша частина зберігається всередині клітин.

У ряду продуцентів антибіотик майже повністю міститься в клітинах організму. Залежно від того, де антибіотичну речовину зосереджено, застосовують відповідні методи його вилучення. Так, якщо антибіотик знаходиться в культуральної рідини, його виділяють методами екстракції, використовуючи для цього розчинники, які не змішуються з рідкою фазою, осаджують у вигляді нерозчинного з`єднання або сорбують іонообмінні смоли.

Якщо антибіотик міститься в культуральної рідини і в клітинах продуцента, то спочатку антибіотик переводять в фазу, з якої найбільш доцільно його ізолювати. Наприклад, антибіотик, що міститься в культуральної рідини, і клітини з антибіотичним речовиною переводять в осад, з якого антибіотик екстрагують.

Відділення нативного розчину від біомаси і зважених часток проводять методами фільтрації або центрифугування.

Мета хімічної очистки - витяг антибіотика з нативної рідини або з клітин продуцента, його концентрація і звільнення (власне, очищення) від супутніх домішок і в кінцевому рахунку отримання високоочищеного препарату, придатного для відповідного застосування.

У ряді випадків антибіотичні речовини під впливом жорстких зовнішніх факторів (підвищеної температури, високої кислотності або лужності та ін.) Втрачають свої властивості, инактивируются. Тому при їх виділенні і очищенні необхідно дотримуватися максимум обережності.

Основні методи очищення антибіотиків наступні: екстракція, іонообмінна сорбція і осадження.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик