Виробництво вторинних метаболітів: сушка, контроль і розфасовка препарату

Після виділення і хімічного очищення антибіотика його необхідно висушити, т. Е. Видалити з препарату вільну і зв`язану воду. Оскільки більшість антибіотиків в тій чи іншій мірі термолабільни, для їх висушування застосовують методи, що не приводять до втрати біологічної активності, що не змінюють кольору препарату. На сучасному етапі промислового отримання антибіотиків використовують такі методи зневоднення.

це:
• Лиофильная сушка антибіотиків - широко поширений метод, він проводиться при порівняно низьких температурах (-8 - -12 С).

• Висушування із застосуванням розпилювальної сушарки - прогресивний метод при роботі з великими кількостями антибіотика, розчин антибіотика пневматично розпорошується до найдрібніших крапель в камері з потоком нагрітого повітря. Процес висушування антибіотиків займає кілька секунд, при цьому навіть термолабільні препарати не змінюють властивостей.

• Метод зваженого шару (або сушка в вакуум-сушильних шафах) застосовується для висушування зернистих і пастоподібних антибіотичних препаратів.

Контроль препарату. Готовий антибіотик піддається ретельному контролю: біологічному і фармакологічній.
При біологічному контролі ставиться завдання з`ясування стерильності готового препарату. Для цього зазвичай використовують два методи.

Перший пов`язаний з інактивацією антибіотика і висівом його в відповідну живильне середовище. Наприклад, біологічний контроль бензилпеніциліну і напівсинтетичних препаратів, отриманих на його основі, проводиться наступним чином. У пробірки, містять тіогліколевую середу, вносять фермент пеніціллазу в кількості, здатній повністю інактивувати пеніцилін. Пробірки з пеніціллазой витримують дві-три доби при температурі 37 ° С для контролю стерильності ферменту, потім в них вносять розчин пеніциліну. Пробірки поділяють на дві групи: одну витримують при 37 ° С, а іншу - при 24 С протягом п`яти діб. Ведуть щоденне спостереження за можливим розвитком мікроорганізмів.

Другий метод з`ясування стерильності антибіотиків визначається тим, що для більшості цих сполук немає інактиваторів їх біологічної активності. Тому у досліджуваних препаратів виявляють стійкі до них форми мікроорганізмів, а також визначають можливу присутність чутливої мікрофлори. Для визначення можливої присутності в таких препаратах чутливої до них мікрофлори розчин антибіотика пропускають через мембранні фільтри з діаметром пор не більше 0,75 мк.

Фармакологічний контроль. До антибіотичним речовин, які використовуються в медичній практиці, відповідно до Державної Фармакопеї пред`являються дуже строгі вимоги. Кожен новий лікарський препарат, перш ніж він буде дозволений до практичного застосування, повинен пройти всебічні випробування на токсичність, пірогенність і інші властивості, життєво важливі для організму. Препарат вивчають на різних видах тварин щодо його гострої і хронічної токсичності (вплив на кров, ЦНС, дихання і т. Д.).

Показники гострої токсичності - один з критеріїв якості антибиотического речовини. Встановлюють максимально переноситься дозу (МПД) антібіотіка- дозу, що викликає загибель 50% піддослідних тварин (LD50) і смертельну дозу (LD100). Тільки після всебічного і ретельного вивчення препарату він може бути рекомендований до практичного застосування.

Розфасовка і упаковка антибіотика - завершальний етап роботи. Розфасований і упакований антибіотик із зазначенням показника біологічної активності, дати випуску і терміну придатності надходить у продаж.

Узагальнюючи весь багатостадійний і багатоступінчастий процес отримання антибіотика, можна відзначити, що він включає в себе чотири основні стадії:
I стадія - отримання відповідного штаму, продуцента антибио-тика, придатного для промислового виробництва;
II стадія безпосередньо пов`язана з процесом біосинтезу антибіотика;
III стадія - це процеси виділення і очищення утворився в ході біосинтезу антибіотика;
IV стадія включає в себе операції, пов`язані з концентрацією антибіотика, його стабілізацією і отриманням готового продукту.

Біотехнологічний процес отримання антибіотиків можна представити у вигляді такої схеми (рис. 4.7).


Виробництво пеніцилінів У 1871 р В .А. Манасеіной було встановлено, що зелена цвіль Penicillium glaucum при своєму зростанні знищує бактерії, що потрапляють в культуральне середовище. Це властивість Penicillium було тоді ж використано лікарем А. Г. Полотебневим, який застосував змочені цієї цвіллю пов`язки при лікуванні гнійних ран і виразок.

Видатне відкриття російських учених не отримало широкої популярності, і в 1928 р англієць Олександр Флемінг вдруге виявив здатність цвілеві грибки Penicillium пригнічувати ріст мікроорганізмів. Було показано, що викликається цвіллю загибель мікробів обумовлена утворенням невідомого органічної речовини, названого пеніциліном. Однак виділення пеніциліну в чистому вигляді в той же час здійснено не було, так як він виявився речовиною дуже лабільною, а застосовувалися методи очищення були недосконалі.

У роки Другої світової війни величезна практична потреба в ефективних антибактеріальних препаратах привернула до пеніциліну увагу широкого кола фахівців, і приблизно з 1939 року почався період інтенсивних досліджень. Завдяки цьому у відносно короткий термін (3-5 років) англійцями Х. Флорі і А. Четтеном були розроблені способи промислового добування та очищення пеніциліну, вивчені його лікувальні властивості і методи клінічного застосування, а також встановлена його хімічна структура.

До пеніцилінів відноситься група близьких за хімічними властивостями сполук, що містять у своїй структурі b-лактамні і тиазолидинового кільця:
R може мати різні значення, залежно від типу пеніциліну. Наприклад, при R = -CH2C6H5 - це бензілпеніціллін- R = -CH2-0-C6H5 - це феноксиметилпенициллин і т. Д. Наявність карбоксильної групи надає молекулі пеніциліну сильні кислотні властивості, тому пеніцилін легко утворює солі з лугами (Na, K), а також з органічними основами, наприклад з дибензилетилендіамін (препарат - біцилін).

Для практичних цілей медицини пеніцилін отримують в промисловості шляхом біосинтезу. Процес біосинтезу складається з наступних стадій: 1) вирощування посівного матеріалу (мікроорганізмів) в апаратах малої місткості - інокуляторах- 2) вирощування посівного матеріалу в великих посівних апаратах- 3) процесу ферментаціі- 4) виділення антибіотика з культуральної рідини і його очищення.

Важливе значення має також селекційний добір високопродуктивних штамів цвілі, підготовка і стерилізація живильного середовища і апаратури.

Дуже важливе значення для високого виходу пеніциліну має живильне середовище, приблизний склад якої (в%) наступний:
Замість какурузного настою успішно застосовується борошно з бавовняних насіння або м`ясні гідролізати.

Приготовану живильне середовище піддають стерилізації. Процес ведуть в колонах безперервної дії.

Далі живильне середовище надходить в апарат-видержіватель, де охолоджується протягом певного часу до температури 23-25 С.

Перша стадія процесу - вирощування стандартної колонії штамів цвілі Penicillium chrysogenum - проводиться в інокуляторах на живильному середовищі, де процес йде ~ 30 годин. Підготовлений інокулят передають в посівної апарат, обсяг якого ~ в 10 разів більше обсягу інокулятора. У посівному апараті знаходиться також стерилізована живильне середовище. Процес зростання тут йде ~ 15-20 годин, і далі посівний матеріал передається на ферментацію в великі реактори - ферментатори об`ємом до 100 м на живильне середовище. Процес ферментації йде ~ 70 годин при температурі 23-24 С, рН середовища 6-6,5 і постійної аерації повітря - 1 л повітря / 1 літр поживного середовища / 1 хв по всьому об`єму ферментатора.

Основне завдання цього процесу - створення оптимальних умов для розвитку продуцента і накопичення антибіотика.

Біосинтез антибіотика - двофазний процес. Протягом першої фази відбувається швидке зростання і розмноження міцелію або бактеріальних клітин. Культуральна рідина в цей період багата вуглеводами, азотом і неорганічним фосфором. Продукти обміну речовин мікроорганізмів, в тому числі і антибіотики, знаходяться в малих кількостях.

Друга фаза починається з моменту уповільнення зростання культури. Протікає вона в культуральної рідини, збагаченої продуктом життєдіяльності організму з невеликою кількістю вуглеводів і фосфору. На початку цієї фази міцелій має максимальну здатністю до синтезу антибіотика. Фази відрізняються характером і інтенсивністю біохімічних реакцій. З урахуванням цих відмінностей підбирають умови, сприятливі для першої і другої фаз розвитку продуцента.

Для збільшення виходу антибіотика в живильне середовище вводять «попередники», т. Е. Хімічні речовини, що сприяють цілеспрямованому синтезу антибіотика. Так, в живильне середовище при біосинтезі пеніциліну вводять «попередник» фенілацетамід це збільшує вихід антибіотика більш ніж в 2 рази.

Після закінчення процесу ферментації культуральну масу передають на процес виділення антибіотика.

Більшість продуцентів при біосинтезі виділяють антибіотик в водну фазу, тому процес виділення антибіотика починається з розділення твердої і рідкої фаз.

Тверда фаза, крім маси міцелію, містить значну кількість колоїдних домішок, що ускладнюють фільтрування, тому культуральну масу попередньо піддають різним типам коагуляції (електролітичної, теплової, кислотної і т. Д.). Найбільш ефективним методом коагуляції культуральної маси є її обробка флокулянтами (високомолекулярними поліелектролітами), наприклад, полі- (4-вініл) -бензілтріметіламмонійхлорідом.

Що залишився від фільтрації міцелію водний розчин антибіотика направляють на хімічне очищення і виділення. Таким чином, водний розчин пеніциліну направляють після фільтрації на екстракцію бутил-ацетатом при рН водного середовища, рівної 2. При такому значенні кислотності середовища пригнічує кислотна іонізація пеніциліну в водної фазі і він переходить в органічну фазу (в бутилацетат). Реекстракції пеніциліну з бутилацетата проводять слабкими розчинами лугів.

Широко застосовуються сорбційні методи виділення і очищення антибіотиків. У якості сорбентів широко використовуються синтетичні іонообмінні смоли.

Сушать пеніциліни методом сублімації або розпилення.

Загроза резистентності Успіхи застосування бензилпеніциліну в лікуванні хвороб, викликаних різними бактеріями, були справді сенсаційними. Чутливими до нього виявилися і стафілококи, які є збудниками дуже серйозних захворювань.

Статистичні дані показують, що в 1944 р число інфекційних хворих, вилікуваних бензил-пеніциліном, було близько 99,8%, проте, вже в 1956 році цей відсоток знизився до 65%, особливо великий відсоток інфікованих хворих, які не піддавалися лікуванню бензилпенициллином, спостерігався серед працівників підприємств, які виробляють антибіотики, і працівників хірургічних клінік, широко використовують антибіотики для лікування хворих.

Чому ж саме ці заклади стали розсадниками хвороботворних організмів, стійких до дії пеніциліну? Вже з часу першого застосування пеніциліну стало відомо, що деякі стафілококи несприйнятливі до нього. Чутливі до пеніциліну штами стафілококів гинуть при лікуванні, залишаються резистентні стафілококи, які починають розмножуватися і заповнювати спорожнілу нішу. І, таким чином, застосування пеніциліну для лікування захворювань, викликаних резистентними формами стафілокока, не приведе до позитивного результату.

Яким же шляхом уникають загибелі стафілококи, резистентні до пеніциліну? Було встановлено, що вони здатні знешкодити молекулу пеніциліну, змінивши його структуру в самому слабкому місці. Стійкі стафілококи виробляють фермент, який може зруйнувати молекулу пеніциліну при додаванні до неї молекули води. При цьому процесі (гідролізі) утворюється з`єднання, нешкідливе для мікробів.

Фермент, що сприяє реакції «знешкодження», називається пеніциліназою. Його виникнення викликається присутністю в середовищі пеніциліну. З 1969 р стала відома і хімічна структура пеніцилінази, що виробляється стафілококами. У побудові її молекули беруть участь 257 структурних одиниць двадцяти амінокислот, з`єднаних в різній послідовності.

Інші бактерії утворюють ферменти (ацілази), які розривають зв`язок між основним ядром молекули бензилпеніциліну і її бічній ацильної групою, утворюючи біологічно неактивну 6-амінопеніцілановую кислоту
Друге розщеплення вчені стали використовувати для своїх цілей як можливість змінити молекулу пеніциліну таким чином, щоб ацілаза не змогла поставити під її гідролізу. Таким способом були отримані нові напівсинтетичні пеніциліни.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик