Методи мікроскопічного дослідження мікроорганізмів

Відео: Мікробіологія. Приготування фіксованих препаратів (Е. Звонарьова)

Найдрібніші розміри мікроорганізмів обумовлюють використання для вивчення морфології бактерій точних оптичних приладів - мікроскопів. Найбільш часто застосовуються светлопольная мікроскопія, мікроскопія в темному полі, фазово-контрастна і люмінесцентна мікроскопія. Для спеціальних мікробіологічних досліджень використовується електронна мікроскопія.

Светлопольная мікроскопія

Светлопольная мікроскопія здійснюється за допомогою звичайного світлового мікроскопа, основною частиною якого є об`єктив. На оправі об`єктивів позначається збільшення: 8, 10, 20, 40, 90.

При дослідженні мікробів застосовується імерсійна система (об`єктив). Іммерсійний об`єктив занурюють в краплю кедрової олії, нанесеного на препарат. Кедрова олія має такий же коефіцієнт заломлення, як і скло, і цим досягається найменше розсіювання світлових променів (рис. 1.12).


Зображення, що отримується в об`єктиві, збільшує окуляр, що складається з двох лінз. У вітчизняних мікроскопах застосовуються окуляри зі збільшенням 7, 10, 15 (рис. 1.13). Загальне збільшення мікроскопа визначається твором збільшення об`єктива на збільшення окуляра. В мікробіології зазвичай використовуються збільшення в 900-1000 разів. Якість мікроскопа залежить не від ступеня збільшення, а від його роздільної здатності.


Під цим треба розуміти найменшу відстань між двома точками препарату, при якому вони ще чітко помітні під мікроскопом. Роздільна здатність звичайних світлових мікроскопів з иммерсионной системою дорівнює 0,2 мкм.

темнопольна мікроскопія

Мікроскопія в темному полі зору заснована на такому принципі (рис. 1.14). Промені освітлюють об`єкт не знизу, а збоку і не потрапляють в очі спостерігача: поле зору залишається темним, а об`єкт на його тлі виявляється світиться. Це досягається за допомогою спеціального конденсора (параболоїд) або звичайного конденсора, прикритого в центрі гуртком чорного паперу.


Препарати для темнопольной мікроскопії готують по типу «висячої» і «роздавленої» краплі. При приготуванні препарату «роздавлена» крапля досліджуваний матеріал (бактеріальну культуру в фізіологічному розчині) наносять на предметне скло, яке покривають покривним склом. Крапля матеріалу заповнює весь простір між покривним і предметним склом, утворюючи рівний шар. Для приготування «висячої» краплі необхідно використовувати спеціальні предметні скельця з поглибленням в центрі і покривні скла.

На середину покривного скла наносять досліджуваний матеріал. Краї поглиблення на предметному склі змащують вазеліном, і їм накривають покривне скло так, щоб крапля знаходилася проти центру поглиблення. Потім перевертають препарат покривним склом вгору. Темнопольна мікроскопія використовується для вивчення живих нефарбованих мікроорганізмів.

Фазовоконтрастна мікроскопія

При проходженні пучка світла через незабарвлений об`єкт змінюється лише фаза коливання світлової хвилі, що не сприймається людським оком. Щоб зображення стало контрастним, необхідно перетворити фазові зміни світлової хвилі в видимі амплітудні. Це досягається за допомогою фазово-контрастного конденсора і фазового об`єктива (рис. 1.15).


Фазово-контрастний конденсор є звичайним об`єктив з револьвером і набором кільцевих діафрагм для кожного об`єктива. Фазовий об`єктив забезпечений фазової платівкою, яку отримують нанесенням солей рідкоземельних елементів на об`єктив. Зображення кільцевої діафрагми збігається з кільцем фазового пластинки відповідного об`єктива.

Фазовоконтрастна мікроскопія значно підвищує контрастність об`єкта і використовується для вивчення нативних препаратів.

люмінесцентна мікроскопія

Люмінесцентна мікроскопія заснована на здатності деяких речовин під впливом падаючого на них світла випускати промені з іншого (зазвичай більшої) довжиною хвилі (флюоресцировать). Такі речовини називають флюорохромами (акридіновий жовтий, родамін і ін.). Об`єкт, оброблений флюорохромом, при освітленні ультрафіолетовими променями набуває яскравий колір в темному полі зору.

Основною частиною люмінесцентного мікроскопа є освітлювач, який має лампу ультрафіолетового кольору і систему фільтрів до нього (рис. 1.16). Дуже важливо використання нефлуоресцентного иммерсионного масла.
Люмінесцентна мікроскопія в практичній мікробіології використовується для індикації та ідентифікації збудників інфекційних захворювань.

Електронна мікроскопія

Можливості оптичних мікроскопів обмежені занадто великою довжиною хвилі видимого світла (6000 А). Об`єкти, розміри яких менше цієї величини, знаходяться за межами роздільної здатності світлового мікроскопа. В електронному мікроскопі замість світлових хвиль використовуються електронні промені, що володіють надзвичайно малою довжиною хвилі і високою роздільною здатністю (рис. 1.17).


Як джерело електронних променів застосовують електронну гармату, основою якої служить шляхом утворення, нагріта електричним струмом. Між вольфрамовою ниткою і анодом на шляху електронів знаходиться електричне поле високої напруги. Електронний потік викликає світіння фосфоресцирующего екрану. Проходячи через об`єкт, частини якого мають різну товщину, електрони будуть відповідно затримуватися, що проявиться на екрані ділянками затемнення. Об`єкт набуває контрастність.

Препарати для електронної мікроскопії готують на найтонших колоїдних плівках, досліджують об`єкти після їх висушування ( «нативні препарати»), напилення за допомогою важких металів, ультратонких зрізів методу реплік і ін.

За допомогою електронної мікроскопії можна виявити найдрібніші структури, отримати збільшення до 200 000 і побачити об`єкти розміром 0,002 мкм.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик