Експериментальні підходи до продовження життя. Зв`язування білкових молекул

Застосування речовин, що перешкоджають перехресного зв`язування білкових молекул

наростаючу при старінні «Пессимальной структуризацію» молекул білків і нуклеїнових кислот як один з провідних факторів онтогенезу для молекулярного рівня організації життя брали в теорії затухаючого самооновлення протоплазми Нагорний (1940), Нікітін (1940, 1954), Буланкін і Парина (1962).

Спеціально по відношенню до поперечного «зшивання» білкових молекул як ведучому фактору онтогенезу таку теорію розвинули Бьеркстен і співавт. (Bjorksten, 1958, 1971- Bjorksten et al., 1962), Оеріу і співавт. (Oeriu, 1962- Oeriu, Oeriu, 1968), Сайнекс (Sinex, 1965), Ла Белла і Пуалу (La Bella, Paul, 1965) - Леонов і Дубина (1966, 1971).

Бьеркстен (Bjorksten, 1958) в модельних експериментах знайшов, що цілий ряд властивих організму метаболітів і неорганічних речовин може викликати поперечну зшивання білкових молекул (зокрема желатин).

До них належать ацетальдегід, метілгуанідін, а-кетоглутарова кислота, піровиноградна, лимонна, фумарова, бурштинова і малонова кислоти, т. Е. Компоненти окислювального (Трікарбонових) циклу Кребса, мідь, залізо, магній, цинк, алюміній і свинець.

Вже перерахування цих речовин показує, що вони - обов`язково властиві обміну речовин і складу крові компоненти, концентрація яких мало змінюється з віком. Це знижує ймовірність того, що саме їм належить провідна роль у притаманному старості пессимальной асоціювання білкових молекул.

До цього слід додати, що сама асоціація у вирішальній здебільшого не спонтанний процес, який залежить тільки від властивостей білкових молекул, а перш за все ферментативно керований процес (Нікітін та ін., 1977). Оеріу (Oereu, 1962) головною зв`язком між білковими молекулами вважав дисульфідні містки і відповідно рекомендував для продовження життя застосування метіоніну і цистеїну.

Нарешті, Леонов і Дубина (1966, 1971) розглядали як дуже важливий фактор поперечного зшивання білків іони перехідних металів. Звідси їх рекомендація (Дубина, Разумович, 1975) застосовувати комплексони як чинники геротерапіі.

застосування латірогенов

Особливе місце в теоріях «зшивок» відводиться домінуючому опорного білку сполучної тканини - колагену (Богомолець, 1940- Sobel, Marmorston, 1956- Bjorksten, 1958). Для нього було з достатнім ступенем вірогідності встановлено вікове наростання поперечних зшивок (La Bella, Paul, 1965 Piez, 1968 Нікітін та ін., 1977).

Ряд дослідників застосували для усунення надмірного поперечного зв`язування молекул колагену відомі в медицині латірогени (речовини, що розривають міжмолекулярні зв`язки колагену). Кон і Лиш (Kohn, Leach, 1967) використовували з цією метою в-амінопропіонітріл. Виявилося, що в застосованих дозах препарат не збільшував тривалість життя щурів і в перший рік життя необоротно пригнічував ріст тварин. Поки не отримано позитивних результатів і з іншим латірогеном - а-пеніциліном (Comfort et al., 1971).

З`ясувалося тільки, що пеніциламін, який вводиться протягом 2 тижнів в їжу щурів в кількості 0.25% від маси тіла, значно підвищує частку розчинної колагену в шкірі та підшкірній гранулеме цих тварин, що розглядалося авторами як ознака його дефектності. Основним обмеженням в застосуванні латірогенов як геропротекторов слід вважати загальність і знеособленість їх дії на всі види колагену організму.

Тим часом далеко не всяке структурне утворення в організмі, в якому бере участь колаген, потребує його знеособленому розпушенні і солюбилизации. Саме тому латірізм - вкрай небажаних наслідків у в структурі сполучної тканини, прояв патології, а не фізіології.

Застосування комплексонів (хелатних агентів)

Застосування хелатних речовин, що пов`язують перехідні метали, що лежать в основі пессимальной в старості структуризації білкових і нуклеїнових комплексів, було вперше запропоновано Дубиною і Леоновим (Дубина, Леонов, 1968 Дубина, 1971- Леонов, Дубина, 1971). Разом з тим ще раніше Бьеркстен (Bjorksten, 1958) і Лансінг (Lansing, 1951) брали ряд іонів металів (або кальцій) за фактори перехресного зв`язування білкових молекул.

У перехресному зв`язуванні, за участю перехідних металів, можуть утворюватися комплекси білків з фосфоліпідами (Fullington, Hendrichson, 1966), а також потрійні комплекси типу зв`язування гліцину з сироватковим альбуміном при посередництві цинку (Gurd, Wilcox, 1956). Лансінг (Lansing, 1942) спробував послабити сшивающее дію кальцію на білки протоплазми, вивчаючи тривалість життя (ПЖ) коловерток, які розміщені періодично в слабкий розчин цитрату.

У його дослідженнях це призводило до деякого продовженню їхнього життя. Дуже широко в ряді ретельних досліджень вивчила дію етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) на тривалість життя щурів Дубина (1970, 1975). У всіх цих дослідах, за рідкісним винятком, не було отримано обнадійливих результатів. Не дали сприятливого результату і досліди Дубиною (1975) із застосуванням інших хелатних агентів - унітіолу (2,3-димеркаптопропансульфонат натрію) і пеницилламина (диметилцистеина).

Застосування факторів, що зменшують зшивання білкових молекул по дисульфідні містках

Рекомендації застосування містять сульфгідрильні групи речовин (цистеїну, метйоніна і ін.) Як засоби розмикання дисульфідних містків в гіперструктурірованних старіючих білкових молекулах висунуті Пархона і співр. (Parhon et al., 1961) і особливо Оеріу (Oeriu, 1962- Oeriu et al., 1968). У цих дослідженнях для ряду тканин лабораторних тварин було показано деяке наростання з віком дисульфідних містків в білках.

Виходячи з цього, Оеріу рекомендував збагачення раціону людей похилого віку метионином, цістеіномі фолієвою кислотою (вітамін групи В). Запропонований ним комплексний препарат називається фолупетаіном. У більш пізній роботі Нікітіна і співавт. (1977) встановлено, що наростання з віком дисульфідних містків притаманне далеко не всім групам тканинних білків і не для всіх тканин.

Висловлено припущення, що наростаючі з віком пессимальной структуризація і ассоциированность білкових молекул можуть здійснюватися не тільки по дисульфідні зшивання. Однак в тих білках, де ці зшивання, виходячи зі структури молекул, можливі (гемоглобін, кератину і сироватковий альбумін), вдається показати наростаючу з віком зшивання по дисульфідні містках.

Шляхи впливу на геном і белоксинтезирующий апарат клітини

Пошуки в цій області безсумнівно в перспективі виявилися б найбільш плідними і на молекулярному рівні організації протоплазми фундаментально вирішальними проблему експериментального продовження життя і в цілому управління віковим розвитком організму.

Завдання, які може ставити тут експериментальна геронтологія, можуть бути згруповані таким чином:

а) спроби захисту (екранування) генома клітини від шкодять і спотворюють процеси нуклео- і протеосінтеза впливів факторів (фізичних і хімічних) навколишнього його внутрішньоклітинної та позаклітинної середовища;
б) стимуляція процесів і ферментних систем, репаріірующіх виникають вікові ушкодження і «підвезення» до клітин і тканин вихідних речовин для синтезу і лагодження ДНК;
в) запобігання генома від, можливо, що виникають у процесі його функціонування (транскрипції РНК) явищ «зношування»;
г) активне втручання в саму структуру геному, його макромолекулярний склад і включення в молекули ДНК (генний набір) нових генів і їх комплексів з метою внесення в «програму вікового розвитку» організму нових, що підвищують «запас його міцності» і подовжують життя організму ознак і груп ознак. Такі дії можуть здійснюватися методами генної інженерії і генотерапії.

Перший шлях впливів на геном клітини - Його запобігання шкідливих впливів. Одним з найбільш руйнівних структуру геному (ДНК хромосом) факторів Виленчик (1976) вважає тепловий рух молекул води. На жаль, з великою обережністю запропоноване Виленчик (1976) для продовження життя зниження температури тіла на 2-3 °, яке могло б, за його розрахунками, продовжити життя гомойотермних тварин на 20-25%, зі зрозумілих міркувань, навряд чи може мати реальне застосування.

Стосовно пойкілотермним тваринам зниження температури в деяких випадках приводило до подовження життя (Виленчик, 1970, 1976), проте поки що неясно, яким є його механізм.

Другий шлях впливів на геном клітини - Стимуляція процесів репарації і процесів синтезу нуклеїнових кислот і білків додатком специфічних ферментів і регуляторів і вихідних для синтезу ДНК і білків генома речовин починає інтенсивно розроблятися.

Для нижчих організмів (бактерій) найдейо більше 10 генів, що визначають активність репаративних ферментів (Засухіна, 1973). Репарації широко розвинені в клітинах еукаріотів, хоча, мабуть, їх ефективність дещо менш виражена, ніж у прокаріотів.

Вперше концепцію про істотну роль порушень в репараційних здібностях клітин і організмів в цілому для скорочення їх життя розвинув Александер (Alexander, 1967). За Катлер (Cutler, 1972) і Виленчик (1972), видова ПЖ клітин визначається співвідношенням швидкостей пошкодження і репарації ДНК генома.

Для ряду довго- і коротко-існуючих видів ссавців Харт і Сетлоу (Hart, Satlaw, 1974) показали цю залежність експериментально. У процесах репарації ДНК генома клітини вирішальну роль відіграють здійснюють її ферменти. До них відносяться група специфічних ендо- та екзонуклеаза, полінуклеотідлігази, РНК і ДНК-полімерази і т. Д.

У ряді досліджень робилися спроби стимулювати утворення цих ферментів або введення їх до складу клітини. Деякі види ДНК-аз, що відносяться до репаріірующім ферментам, здатні проникати в клітини ссавців. У ряді досліджень було показано, що низькі дози ультрафіолетового та іонізуючого випромінювання можуть надавати стимулюючу дію на синтез ДНК і репаріірующіх її ферментів.

Була встановлена стимуляція синтезу ДНК в уже диференційованих м`язових клітинах хребетних тварин. Мабуть, завдяки посиленню синтезу ДНК генома і її репарації була продовжена життя деяких нижчих тварин за допомогою малих доз іонізуючого випромінювання здійснюватиме (див. Зведення: Ванюшин, Бердишев, 1977).

У бактеріальних клітинах за допомогою ультрафіолетового опромінення відбувається утворення (мобілізація - В. Н.) особливої, так званої аварійної (SOS) ферментної системи репарації ДНК. Функції цієї системи - усувати під час поділів накопичилися в геномі «помилки» методом рекомбінації. У тваринних клітинах ці механізми функціонують переважно під час мейозу, і це відкриває нові можливості ультрафіолетової стимуляції «виправлення» генетичної програми старіючих клітин тканин (див. Зведення: Виленчик, 1976).

Спроби стимулювати загальну активність старіючого генома клітини поки що не дали істотних результатів. Одним із засобів такого впливу була дача в живильне середовище тканин або в їжу цілісним тваринам організмам екзогенних РНК і ДНК або їх окремих компонентів.

Стосовно культурам тканин Бердишев (1968) при додаванні гетерологічної РНК виявив навіть пошкодження клітин в культурах тканин вищих хребетних тварин, а при додаванні сумарною РНК печінки до фібробластам курячого зародка ніяких змін в їх розвитку не спостерігав. Було отримано деяке підвищення життєздатності при введенні нуклеїнових кислот в організм мишей, щурів і кроликів.

Однак тривалість життя піддослідних тварин при цьому не досліджувалася. У деяких безхребетних тварин (Drosophila melanogaster) препарати ДНК, мабуть, сприяють збільшенню ПЖ (Бердишев і ін., 1965, 1976- Бердишев, Карпенчук, 1977). За останній час було показано (Szabuniewicz, 1977), що вільні фрагменти ДНК, що вводяться в організм тварин (Drosophila melanogaster), порівняно легко включаються в геном клітин організму.

Ці дані роблять в якійсь мірі імовірним безпосереднє дію, «осколків» молекули ДНК на ПЖ організму. Викликає інтерес «омолоджуючу» дію на центральну нервову систему Центрофеноксин - речовини, близького за молекулярною структурою до рослинних ауксином, а також до деяких нейрогормонів.

Виявилося, що центрофеноксін знижує вміст в нейронах мозку морських свинок липофусцина ( «пігменту старіння») і надає омолоджуючий ефект на нервову систему лабораторних тварин і людини (Nandy, 1968). Не виключено, що це дія в значній мірі зводиться до активації генома нейронів.

Управління активністю генома клітини як засіб підтримки повноцінного поновлення протоплазми в усі віки, безсумнівно, має надзвичайно важливе значення. В цьому напрямку можливо уявити ряд досить обґрунтованих експериментальних підходів. За останні роки велике значення в активації процесів репродукції і трансляції в хроматині клітин надається особливим білковим факторів, що дестабілізує вторинну структуру ДНК, інакше кажучи, «розплітає» подвійну спіраль ДНК в хроматині (Lee, Dahmus, 1973- Димшиц, Фет, 1977).

Близьким до цього дію має на ДНК печінки вищих хребетних синтез соматотропного гормону (СТГ) (Галавін, 1977). Звісно ж дуже перспективним використовувати ці фактори в певні періоди онтогенезу для геротерапіі. Звісно ж безсумнівним, що клітина (зокрема її цитозоль) має набагато більшим набором специфічних факторів (ферменти, компоненти білоксинтезуючого апарату клітин, особливі активують геном білки і т. Д.), Концентрація яких послаблюється з віком.

В цьому відношенні проведені дослідження Біелка і співавт. (Bielka, Junghan, 1974- Bielka et al., 1976) за віковою падіння активують трансляцію білків на рибосомах в цитоплазмі при старінні. Клітини мають і більш простими за молекулярною структурою факторами регуляції активності геному і білоксинтезуючого апарату клітини.

Одним з них може бути система поліамінів (Caderera et al., 1976). Володіючи негативним зарядом, вони можуть бути ефективними дерепрессорамі, що зв`язують позитивні заряди гістонів - не тільки структурними, а й репресує факторами генома (див. Огляд: Elgin, Weintraub, 1975). Клейнсміт і Стейн (Kleinsmith, Stein, 1976) виявили особливу підвищення продуктивності лікарських на транскрипцію гістонових генів хромосомального фосфолипидами.

Це - ще один напрям пошуків регулюючих факторів активності геному клітини. Каріон клітини має чи в інший спосіб управління активністю і характером функціонування генома, що змінюються з віком.

Саме в онтогенезі відбуваються зміни не тільки в макромолекулярному складі хроматину, співвідношенні в ньому ДНК і різних фракцій гістонових і особливо негістонових білків і фосфоліпідів (Мартиненко та ін., 1972- Нікітін та ін., 1976б- Бердишев, Желябовская, 1972- Клименко, 1974 , 1975- Клименко та ін., 1975, 1976), але і в метилировании, ацетилюванні і фосфорилировании різних фракцій білків хроматину.

Як зрушення в макромолекулярному складі генома, так і зв`язування білкових фракцій (а також ДНК) хроматину з ацетильную, метальнимі і фосфатними групами можуть надавати і безсумнівно надають специфічну дію на процеси синтезу нуклеїнових кислот (Георгієв, 1973) і білків в клітині (Elgin, Weintraub , 1975- Rubin, Rosen, 1975- Romberg, 1977- Ванюшин, Бердишев, 1977).

Зокрема, передбачаються репресує вплив ряду фракцій гістонів і дерепрессірующее вплив фосфоліпідів в хроматиновой комплексі генома. Поки що є лише дуже небагато досліджень з спробами впливати на геном клітини виборчим впливом ізольованих фракцій білків хроматину і стимуляцією процесів метилування і ацетилювання ДНК і білків генома клітини (див. Зведення: Elgin, Weintraub, 1975- Клименко, 1975- Нікітін, 1975- Ванюшин , Бердишев, 1977).

Майже відсутні спроби експериментального впливу на геном клітини фосфолипидами хроматину і «обслуговуючими» геном клітини ферментними системами. Нарешті, практично ще дуже мало відомо про фактори, що можуть специфічно впливати на макромолекулярні зрушення в складі генома і на обмениваемость і активацію його компонентів у віковому аспекті.

Третій шлях впливів на геном клітин - Це захист його від можливого надлишкового руйнування ( «зношування») при процесах нуклео- і протеосінтеза. Саме такий підхід був застосований Фролькісом (1976) при використанні ін`єкцій Олівоміцін як геропротектора у лабораторних тварин (білих щурів).

Олівоміцін вводився внутрішньочеревно в дозі 50 мкг / кг маси тіла в 2 мл фізіологічного розчину щодня протягом 1.5 років, курсами по 10 днів, з перервами в 1 міс. Виявилося, що ін`єкції Олівоміцін збільшували тривалість життя піддослідної групи тварин на 15.4% (СПР в контрольній групі - 30.85 міс, в дослідній - 35.62 міс). Інгібітори біосинтезу білка попереджали розвиток експериментального атеросклерозу у старих кроликів (Фролькіс, 1976).

Генна інженерія старості

Потенційні можливості застосування генної інженерії в геротерапіі надзвичайно великі і перспективні. Звісно ж дуже привабливим замінювати в старіючому, що несе на собі «печать віку» геномі клітини місця спотворень первинної структури ДНК, що ведуть до порушення процесів нуклео- і протеосінтеза в клітці і звідси до пессимізації життєдіяльності організму.

При цьому з самого початку слід мати на увазі, що завданням генної інженерії може бути не примітивне видалення якогось одного, «відповідального за старіння» клітини гена. Такого одиночного гена, відповідального за розвиток процесів старіння, в геномі клітини можна собі уявити.

Винятком є припущення Кошланда (Koshland, 1964) про гормон смерті і відповідно гені, запускає в пізньому онтогенезі продукцію цього гормону, яке не знайшло підтримки в сучасній геронтології. Як підкреслював вже давно Нагорний (1940), при старінні в геномі клітини розвиваються множинні зміни, в тій чи іншій мірі охоплюють всі прояви життєдіяльності.

Саме ця надзвичайна складність і комплексність вікових змін геному клітини визначає виняткову складність гармонійного, строго адекватного, складного впливу, необхідного для відновлення структурної та функціональної повноцінності генома старіючої клітини. Природно, це не виключає спроб виборчого введення груп генів, репаруючу пошкоджені гени в період старості.

Генна інженерія в геронтології має перед собою ще одну задачу. Процеси старіння включають в себе не тільки просто «погіршення» генома клітини, але і найскладніші його пристосувальні зміни (Фролькіс, 1970, 1975, 1976). Тому можливо уявити собі і такі пошуки впливів на геном клітини, які включали б «впровадження» в нього нових, спеціальних «пристосувальних» компенсаторних цистрон.

Нарешті, цілком можливо допустити шукання шляхів синтезу і впровадження в старіючий геном людини таких, раніше в ньому не були генів, які б підвищували, особливо в період старості, «запас функціональної міцності» організму.