Cтареніе в клітинних культурах

Відео: Jeunesse Global FINITI ™ Клітинне старіння закінчується тут

Використання клітинних культур в геронтології відкриває унікальні можливості для вивчення механізмів старіння і пошуку впливів, що впливають на цей процес.

Зокрема, метод клітинних культур дозволяє вирішувати наступні важливі завдання.

1. Порівнюючи культури клітин, отриманих від донорів різного віку, можна відрізнити конститутивні вікові зміни від індукованих. Наприклад, встановлено, що мітотична активність культур фібробластів людини, що знаходяться в ідентичних умовах, зменшується з підвищенням віку донора клітин (Schneider, Mitsui, 1976- Schneider, 1979).

Отже, спостерігається в тканинах старіючих організмів зниження мітотичної активності (Gelfant, Smith, 1972- Cameron, Thrasher, 1976) пов`язане з конститутивним зміною самих клітин.

З іншого боку, вікове збільшення періоду індукції тірозінамінотрансферази печінки під дією гідрокортизону (Adelman, 1972) слід вважати індукованим, оскільки в культурах гепатоцитів щурів різного віку ніяких відмінностей в індукції ферменту не спостерігається (Britton et al., 1976). Таким чином, застосування клітинних культур дозволяє встановити природу вікових змін.

2. Метод клітинних культур відкриває унікальні можливості для пошуку і ретельного дослідження конститутивних біохімічних (Виленчик і ін., 1979) і цитологічних (Schneider, 1979) вікових змін. Цей метод дозволяє також безпосередньо перевіряти теорії старіння (Danner et al., 1978).

3. Порівняльне вивчення клітинних культур, отриманих від різних тварин, дає можливість виявити властивості клітин, що представляють особливий інтерес для біології старіння. Наприклад, встановлено, що ПЖ тварин позитивно корелює зі здатністю фібробластів в культурі репарирувати УФ-індуковані пошкодження ДНК (Hart, Setlow, 1974) і негативно корелює з інтенсивністю зв`язування канцерогенів з ДНК фібробластів цих тварин (Schwartz, Moore, 1977, 1979). Отже, механізми захисту генома від пошкоджень представляють для геронтології особливий інтерес.

4. Тривале культивування (близько року) клітин in vitro дозволяє моделювати багато змін, що відбуваються при старінні організмів. І хоча питання про адекватність умов in vitro умов in vivo залишається відкритим, старіння клітинних культур присвячується все більше число експериментальних, оглядових (Hay, 1967- Бершадський, Гельфанд, 1970 Cristofalo, 1972- Hayfiick, 1977- Гаврилов, Гаврилова, 1978) і теоретичних робіт (Olovnikov, 1973- Holliday, 1975- Hirsch, 1978- Гаврилов, Ягужинський, 1978).

Критерії та причини загибелі клітинних культур

В даний час встановлено обмежену тривалість життя (ПЖ) наступних клітинних культур: нормальних фібробластоподібних клітин людини (Hayfiick, Moorhead, 1961- Hayfiick, 1965- Harper, Grove, 1979), коні, кількох видів кенгуру (Stanley et al., 1975), сумчастого тваринного Potorous tridactylus (Cristofalo, 1972- Stanley et al., 1975), черепахи (Goldstein, 1974), норки (Hayfiick, 1975), курчати (Kaji, Matsuo, 1979) і миші (Hayflick, 1975, 1977) - епідермальних кератиноцитів (Rheinwald, Green, 1977), клітин глії (Brunk`et al., 1973) і печінки людини (Kahn et al., 1977a, 1977b) нормальних хондроцитов (Mayne et al., 1976) і трансформованих вірусом саркоми Рауса фібробластів курчати (Ponten, 1970 Leblond-Larouche, Morais , 1976).

Однак при критичному аналізі літературних даних (Гаврилов, Гаврилова, 1978) з`ясовується, що до сих пір немає загальноприйнятих кількісних критеріїв загибелі клітинної культури, а самі поняття - «смерть» і «тривалість життя» культури - надзвичайно умовні і суб`єктивні.

Більшість дослідників називають культуру мертвої, якщо протягом довільно заданого інтервалу часу (зазвичай від однієї до чотирьох тижнів) її чисельність перестає збільшуватися до бажаної величини, незважаючи на сприятливі для зростання умови (зазвичай задається чисельність, в 2-4 рази перевищує вихідну чисельність культури) .

За цим визначенням загибель клітин в культурі не обов`язкова, так як будь-яка культура життєздатних, але не діляться клітин, з даного визначення, буде вважатися мертвої. Більш того, мертві культури продовжують повільно рости, хоча вони мають низьку мітотичну активність і містять всього 10-20% клітин, здатних до реплікативного синтезу ДНК (Cristofalo, Sharf, 1973- Milo, Hart, 1976).

Такі культури іноді спонтанно відновлюють нормальні темпи зростання і тоді роблять ще кілька подвоєнь популяції до наступної «смерті» (Holliday, Tarrant, 1972). Масова загибель клітин в кінці життя культури, якої надавалося велике значення в ранніх роботах (Hayfiick, Moorhead, 1961- Hayfiick, 1965), виявилася артефактом, пов`язаних з операцією пересіву.

Справа в тому, що при культивуванні регулярно проводять пересів клітин, т. Е. Обробку прикріпленого до субстрату клітинного шару 0.1% -ним розчином трипсину (тріпсінізаціі) і поділ відкріпив пласта клітин до одиночних шляхом гідродинамічного впливу (суспендування).

При цьому в першу чергу гинуть великі клітини (Milo, 1973), яких найбільше в старих і мертвих культурах (Bowman et al., 1975- Mitsui, Schneider, 1976). Крім того, в цих культурах збільшується число клітинних контактів, які неможливо зруйнувати при пересеве, не пошкоджуючи самих клітин (Milo, 1973).

Тому в умовах повільного зростання культури при постійному руйнуванні клітин в процесі пересіву створювалося враження їх повного лізису. У тих же випадках, коли вплив операції пересіву було виключено, ніякого збільшення швидкості загибелі клітин з віком культури не спостерігалося.

Отже, обмежена ПЖ клітинних культур викликана виключно зниженням мітотичної активності, а не загибеллю самих клітин. Більш того, є підстави припускати, що саме зменшення мітотичної активності є причиною більшості морфологічних і біохімічних змін, що спостерігаються в клітинах старих і мертвих культур.

Наприклад, виявилося, що описані в кінці життя культури «дегенеративні зміни» клітин, яким надавалося велике значення в ранніх роботах (Hayfiick, Moorhead, 1961- Hayfiick, 1965), є не причиною, а наслідком загибелі культури, т. Е. Зниження мітотичної активності. Було виявлено, що багато так звані «дегенеративні зміни» можна отримати і в молодої культурі, придушивши на тривалий термін клітинний розподіл.

Всі ці «дегенеративні зміни» безслідно зникають після декількох подвоєнь популяції, якщо знову створити умови для зростання культури (Brunk et al., 1973). Збільшення розмірів клітин при старінні культур також, мабуть, викликано уповільненням і припиненням клітинного ділення. Дійсно, збільшення розмірів спостерігалося тільки у клітин, вже не синтезують ДНК (Bowman et al., 1975).

Наведені вище факти дозволяють стверджувати, що проблема старіння клітинних культур по суті зводиться до вивчення причин, механізмів і наслідків спостережуваного зниження мітотичної активності.

Цей процес зовсім не обов`язково викликаний пошкодженням і старінням клітин, а може бути наслідком їх диференціювання (Гаврилов, Гаврилова, 1978- Гаврилов, Ягужинський, 1978), яка часто супроводжується зменшенням мітотичної активності (Truman, 1976). Отже, поняття «смерть», «загибель», «старіння» і «тривалість життя» клітинних культур є надзвичайно умовними, так само як і поняття «молоді» і «старі» культури.

Їх вживання налаштовує дослідників на вивчення механізмів порушень і ушкоджень, хоча сам факт існування цих пошкоджень і порушень в клітинній культурі не доведений, а їх роль в зниженні мітотичної активності не встановлена.

Тому доцільно використовувати інші терміни, які б акцентували увагу дослідників саме на тому, що відбувається насправді, т. Е. На зниженні мітотичної активності. Такі терміни вже введені.

Замість понять «тривалість життя», «старіння», «загибель» і «смерть» клітинної культури запропоновано використовувати терміни «репликативная тривалість життя», «реплікативного старіння», «репликативная загибель» і «репликативная смерть» культури клітин.

Поняття «молоді» і «старі» культури також зараз використовуються з прикметником «реплікативний». Молоді (діляться) клітини названі реплікативного, а старі і мертві (неделящиеся) - постреплікатівной.

Для стислості іноді користуються старими поняттями, поміщеними в лапки, підкреслюючи таким чином їх умовність (Norwood et al., 1974 Гаврилов, Гаврилова, 1978). Показово, що зараз навіть біологічний вік культури визначають за процентним вмістом клітин, нездатних до реплікативного синтезу ДНК (Cristofalo, Sharf, 1973- Bowman et al., 1975).

В даний тягар встановлені наступні основні прояви «старіння» клітинних культур.

1. Зменшується частка клітин, здатних ділитися (Merz, Ross, 1969- Cristofalo, Sharf, 1973).

2. Збільшується період мітотичного циклу. Радіоавтографіческім методом виявлено збільшення мінімального періоду генерації клітин в культурі фібробластів людини з 16 до 21-22 год (Macieira-Coelho et al., 1966). Кінематографічне дослідження виявило збільшення середнього часу між поділами при «старінні» культури фібробластів людини з 16.8 до 32 год (Absher et al., 1974).

3. При «старінні» клітинних культур посилюється гальмівний вплив щільності популяції на швидкість росту (Macieira-Coelho et al., 1966- Absher et al., 1974 Schneider, Mitsui, 1976), тому щільність насичення у реплікативного старих культур виявляється приблизно в 2 рази меншою, ніж у «молодих» культур (Schneider, Mitsui, 1976).