Старіння в клітинних культурах. Межа клітинних поділів

Відео: заміряємо теломери або як прожити довше FINITI від Jeunesse

Чи існує межа клітинних поділів?

Ідея про те, що клітини тварин здатні зробити лише обмежене і чітко визначена кількість поділів, була висловлена ще в 1882 році Вейсманом (Weismann, 1882), докладно обговорювалася Мечниковим (1907), а в даний час отримала експериментальні підтвердження (Micklem et al., 1975- Reincke et al., 1975- Botnick et al., 1976) і стала основою ряду теорій старіння (Olovnikov, 1973- Holliday, 1975).

«Старіння» клітинних культур часто розглядають як основний доказ обмеженою здатності клітин до поділу (Marx, 1974 Reincke et al., 1975- Hirsch, 1977).

Дійсно, встановлено, що реплікативного старіння багатьох клітинних культур відбувається тільки при діленні клітин і не пов`язане безпосередньо з інтенсивністю їх метаболізму.

Наприклад, якщо тимчасово придушити клітинний розподіл в культурах фібробластів людини (зниженням температури, зменшенням концентрації сироватки крові у культуральному середовищі, підвищенням щільності популяції), а потім знову створити умови для зростання, то в таких культурах репликативная загибель настає пізніше на строк, що дорівнює часу перебування культури в непроліферіруюгцем стані.

При цьому число подвоєнь, скоєних клітинної популяцією, не змінюється (див .: Гаврилов, Гаврилова, 1978). Тому «вік» і «тривалість життя» клітинних культур слід визначатимуть не через календарне час, а через число поділок, скоєних клітинами (так зване митотическое час) (Dell Orco 1974- Goldstein, Singal, 1974- Гаврилов, Ягужинський, 1978).

Практично митотическое час висловлюють через число пересівань (пасажів), вважаючи, що один пасаж у відношенні 1: 2 відповідає одному подвоєння популяції (Cristofalo, 1972- Goldstein, 1974), а одне подвоєння - одному поділу клітин культури (Marx, 1974).

Наприклад, культура ембріональних диплоїдних фібробластів людини здатна витримати близько 50 + 10 пересівань в співвідношенні 1: 2 (Hayfiick, 1965) - тому вважають, що дана культура робить 50 подвоєнь популяції (Hayfiick, 1969- Cristofalo, 1972), а клітини цієї культури здатні поділитися 50 разів (Marx, 1974 Дубина, Разумович, 1975).

Однак відомо, що багато клітин в організмі (наприклад, клітини слизової кишечника, шкіри, кровотворні та лімфоїдні клітини) здатні ділитися значно більше 50 разів (Дубина, Разумович, 1975- Cameron, Thrasher, 1976- Hirsch, 1977). Ця невідповідність породило сумніви в можливості застосування клітинних культур для моделювання вікових змін, що відбуваються в організмі (Cristofalo, 1972- Cameron, Thrasher, 1976).

Виявилося, однак, що причина цього протиріччя криється в неправильному розрахунку числа подвоєнь і поділів. По-перше, було виявлено, що через добу після пересіву культури фібробластів людини в живих залишається тільки 50-70% клітин реплікативного молодий культури (Cristofalo et al., 1970) і всього 25% клітин реплікативного старої культури (Good, 1972).

Тому 40-60 пасажів (здаються подвоєнь) відповідають 80-120 істинним подвоєння популяції (з урахуванням загибелі клітин) (Good, 1972). По-друге, не всі фібробласти, які пережили операцію пересіву, здатні ділитися, причому частка клітин, які діляться сильно зменшується при реплікативного старінні (див. Вище). З урахуванням цього факту і постійної загибелі клітин було розраховано, що 40-60 пасажів культури фібробластів людини відповідають 120-160 контрольними позначками клітин (Good, 1972- Hirsch, 1977).

Згідно з іншим, більш точному розрахунку ця величина складає 170 + 30 поділок (Гаврилов, Ягужинський, 1978). По-третє, виявлено, що в «мертвих» культурах фібробластів людини ще залишається 10-20% клітин, здатних ділитися (Cristofalo, Sharf, 1973- Milo, Hart, 1976) - тому взагалі немає ніяких підстав говорити про існування межі числа поділів у всіх клітин культури.

Більш того, аналіз кінетики росту культури фібробластів людини показав, що абсолютна кількість клітин, які діляться в розрахунку на всю популяцію фібробластів (т. Е. З урахуванням операції пересіву) ніколи не зменшується, а в кінці «життя» культура зростає в основному за рахунок утворення неделящихся клітин. Це означає, що реплікативного старіння культури викликано не зникненням діляться фібробластів, а їх розведенням клітці, що не (Гаврилов, Ягужинський, 1978).

Отже, культура може мати обмежену «тривалість життя»Навіть в тому випадку, якщо частина її клітин ділиться необмежено. Як конкретний приклад розглянемо модель, засновану на схемі, запропонованій раніше (Osgood, 1959) для клітин кровотворної системи організму.

Відповідно до цієї моделі, в культурі фібробластів людини існує 2 типу клітин, які діляться: n-клітини, які здатні зробити обмежене число поділок (близько 100), перетворюючись потім в неделящиеся, і а-клітини, які діляться необмежено, причому з а-клітин постійно утворюється деяку кількість n-клітин.

У найпростішому випадку ці умови виконуються, якщо а-клітини діляться асиметрично, утворюючи одну клітку, ідентичну батьківської (а-клітку), а іншу - що відноситься до категорії n-клітин. В даний час асиметричність розподілу вважається характерним властивістю більшості клітин в організмі (Hirsch, 1977).

При такому асиметричному розподілі число а-клітин не може збільшуватися. Неважко помітити, що по даній моделі розведення популяції клітці, що не є неминучим, тому культура клітин матиме обмежену «тривалість життя» навіть в тому випадку, якщо спочатку вона повністю складається з «безсмертних» а-клітин.

Дійсно, виявилося, що ця проста модель дозволяє якісно описати кінетику репликативного старіння культури фібробластів людини (Гаврилов, Ягужинський, 1978).

Можливі механізми репликативного старіння клітинних культур

В даний час конкретні механізми репликативного старіння клітинних культур невідомі, а наявні численні припущення можна звести до двох узагальненим гіпотезам. Концепція накопичення порушень, пошкоджень або помилок розглядає процес репликативного старіння як результат недосконалості різних внутрішньоклітинних систем, наприклад системи перенесення генетичної інформації.

Відповідно до гіпотези перемикання, реплікативного старіння - це процес квазідіфференціровкі клітин культури, аналогічний диференціювання клітин в організмі (Гаврилов, Гаврилова, 1978).

Серед багатьох гіпотез накопичення порушень велике поширення набула гіпотеза «катастрофи помилок» Оргела (Orgel, 1963- Holliday, 1975), згідно з якою на рівні трансляції накопичуються помилки, що призводять до подальшого зменшення точності роботи систем перенесення генетичної інформації.

Однак при аналізі експериментальних підтверджень гіпотези Оргела з`ясовується, що жодне з них не доводить справедливості цієї гіпотези (Гаврилов, Гаврилова, 1978). Найбільш серйозним спростуванням гіпотези накопичення ушкоджень є результати експериментів по зараженню реплікативного молодих і старих культур вірусами герпесу (Holland et al., 1973- Hayfiick, 1974), везикулярного стоматиту (Holland et al., 1973- Pitha et al., 1974) і поліовірусом (Holland et al., 1973- Hayfiick, 1974- Pitha et al., 1974).

У цих роботах вірусна інфекція була використана як метод оцінки стану клітин реплікативного старих культур. Основна перевага вірусного тесту полягає в тому, що він дозволяє охарактеризувати загальний стан клітини і виявити порушення незалежно від їх конкретної природи.

Крім того, цей метод чутливий, так як дозволяє виявити вплив аналогів амінокислот і щільності популяції на стан клітин (Pitha et al., 1975). Так, наприклад, виявилося, що незначні добавки аналогів амінокислот, що знижують швидкість росту культури всього на 20%, призводять до 5-10-кратного зниження числа інфекційних віріонів, що утворюються з однієї клітини (Danner et al., 1978).

Якщо реплікативного старіння дійсно викликано накопиченням порушень в клітинах, то вірусний тест виявив би такі зміни в клітинах «старих» культур: зниження швидкості утворення і дозрівання вірусів, зменшення кількості віріонів, що утворюються на одну клітку, падіння питомої інфекційності вірусів і підвищення їх термолабильности, збільшення частки мутантних вірусів і зміна електрофоретичного спектра вірусних білків.

Однак жодне з цих змін виявлено не було (Holland et al., 1973- Hayfiick, 1974- Pitha et al., 1974, 1975). Це означає, що при реплікативного старінні не відбувається помітного зниження точності роботи систем перенесення інформації та падіння синтезують можливостей клітин.

Останнім часом все більше визнання набуває гіпотеза диференціювання клітин в культурі, згідно з якою реплікативного старіння викликане перемиканням клітинного метаболізму в режим, несумісний з розподілом (Finch, 1976- Rheinwald, Green, 1977- Bell et al., 1978).

Ця гіпотеза добре узгоджується з рахунком поділів, що відбувається при реплікативного старінні. Дійсно, на самих різних об`єктах було показано, що для перемикання метаболізму часто необхідно клітинний розподіл, причому критичний пункт в такому перемиканні збігається з синтезом ДНК. Тому гіпотеза диференціювання добре узгоджується з тим, що «запам`ятовування» числа поділів при реплікативного старінні відбувається в ядрі.

Мабуть, тут ми стикаємося з універсальним механізмом перемикання метаболізму, який поки не вивчений (Truman, 1976- Гаврилов, Гаврилова, 1978). Гіпотеза диференціювання пророкує, що гібридна клітина, утворена з постреплікатівной і трансформованої клітин, повинна бути здатна до поділу. Справді, виявилося, що гетерокаріонов постреплікатівной фібробластів людини з гетероплоіднимі клітинами золотистого хом`ячка здатний зробити більше 100 клітинних генерацій (Goldstein, Lin, 1972).

Показано також, що ядра постреплікатівной фібробластів людини після гібридизації з клітинами HeLa або з трансформованими фібробластами людини починали синтезувати ДНК (Norwood et al., 1975). Виявлено, що реплікативного старіння культур фібробластів людини пов`язано зі зникненням мРНК негістонових ядерних білків, що беруть участь в активації генома при клітинному розподілі (Stein, Burther, 1975).

Це явище добре пояснюється, якщо врахувати наступні експериментальні факти: при реплікативного старінні змінюється спектр ядерних білків, і це змінює структуру хроматину так, що його матрична активність щодо синтезу РНК зменшується (Baserga, Nicolini, 1976). Отже, реплікативного старіння можна розглядати як процес перемикання активності геному, т. Е. Як процес диференціювання.

На відміну від концепцій накопичення ушкоджень гіпотеза диференціювання легко узгоджується з фактами про неуніверсальної поширеності репликативного старіння, оборотності переходу в постреплікатівной стан, високої точності та швидкості біохімічних процесів в постреплікатівной клітинах і низькій швидкості загибелі цих клітин.

Нарешті, було прямо показано, що обмежена «тривалість життя» культур епідермальних кератиноцитів людини пов`язана з диференціюванням цих клітин (Rheinwald, Green, 1977). Що стосується фібробластів, то відомо, що ці клітини можуть диференціюватися в культурі з утворенням неделящихся адипоцитів (Portugal, 1979).

Можливо, що цей процес і лежить в основі репликативного старіння фібробластів, але недостатність культуральної середовища по ряду факторів (наприклад, біотину) заважає нормальній експресії нового фенотипу. Таким чином, хоча гіпотеза диференціювання клітин в культурі остаточно не доведена, вона значно краще відповідає наявним експериментальним даними, ніж концепція накопичення порушень.

Співвідношення між старінням багатоклітинних організмів і клітинних культур

Інтерес геронтологів до самого явища «старіння» клітинних культур багато в чому залежить від того, наскільки воно пов`язане зі старінням організмів. Певне відповідність між двома цими явищами дійсно існує (Cristofalo, 1972- Hayfiick, 1977- Гаврилов, Гаврилова, 1978).

Наприклад, встановлено, що репликативная тривалість життя клітинних культур зменшується зі збільшенням віку донора клітин (Schneider, Chase, 1976- Schneider, Mitsui, 1976). Крім того, «тривалість життя» клітинних культур, отриманих від різних тварин, корелює з тривалістю життя цих тварин (Hayfiick, 1975).

Однак ці факти зовсім не доводять, що в основі старіння організму лежить обмежена здатність його клітин до поділу. Якби це було так, то всі нормальні клітини тварин мали б обмежену «тривалість життя» в культурі.

Насправді ж існує ряд культур клітин тварин, здатних в необмеженому зростанню (Cristofalo, 1972- Finch, 1976). Заперечення Хейфліка (Hayfiick, 1977), що такі клітини могли мати відхилення від нормального диплоидного кариотипа, в даний час не може бути прийнято, оскільки в «старіючих» культурах фібробластів людини диплоїдний каріотип також не зберігається.

Дійсно, реплікативного старі фібробласти людини містять 6% поліплоїдних і 43% анеуплоідних клітин (Thompson, Holliday, 1975). З іншим твердженням Хейфліка, що необмежена здатність до поділу характерна тільки для трансформованих клітин (Hay-flick, 1965), також не можна погодитися.

Наприклад, нормальні клітини імагінальних дисків дрозофіли здатні до необмеженого росту (Finch, 1976). З іншого боку, культура фібробластів курчати, трансформованих вірусом саркоми Рауса, має обмежену репликативную тривалість життя (Ponten, 1970 Leblond-Larouche, Morais, 1976).

Таким чином, ні трансформація, ні зміна каріотипу не мають прямого відношення до «старіння» клітинних культур.

Дослідження «старіння» клітинних культур дозволяє з`ясувати причини зниження мітотичної активності та механізми регуляції клітинного ділення. Це може бути корисним у вивченні закономірностей зниження регенераторних можливостей і атрофії тканин при старінні організму.