Ендокринологія вплив ферментів протеолізу на метаболічну активність клітин головного мозку і нейтрофільних лейкоцитів білих щурів

Відомо, що протеолітичні ферменти (трипсин, хімотрипсин і інші) в ряді випадків мають виражену протівовоспалітельноедействіе. У зв`язку з цим, ферменти-протеази порівняно шірокоіспользуются для лікування різних груп запальних захворювань: бронхо-легеневих, гінекологічних, стоматологічних, опухолевихпроцессов (2,7,14), а також у профілактиці запалення в хірургії (6). Тим часом механізми профілактичний і лікувальний действіяпротеолітіческіх ферментв при запальних процесах остаютсянедостаточно вивченими. Найбільш повно висвітлена і аргументірованав літературі роль некро- і фибринолитического (тромболітичної) ефектів протеаз в їх протизапальну дію (5,6). Однаков літературі мало даних про прямий вплив протеаз на метаболіческуюактівность клітин організму.

Метою роботи стало експериментальне ісследованіевліянія трипсину і калікреїну на активність ферментів аеробногоокісленія в нервових клітинах і макрофагах, які грають провідну рольв попередженні запального процесу (гематоенцефаліческійбарьер).

Матеріали та методи.

Експерименти проведені на 61 білих щурах-самцях популяції Вістармассой 200-250 г. Виконано 10 серій дослідів: 6 серій - контрольних, у яких вивчено активність дегідрогеназ в нейтрофільних лейкоцітахі в системі "нейроціт-нейроглії" кори головного мозгаінтактних тварин, при введенні 0,85% растворахлорістого натрію, інактивованої трипсину і калікреїну (39крис) - 4 серії - досвідчених, в яких вивчені активність дегідрогеназнейроцітов при введенні активного трипсину і калікреїну, а також активність дегідрогеназ і зміст глікогену в нейтрофільнихлейкоцітах щурів при введенні досліджуваних актівнихферментов (24 тварин). Досліджувані препарати вводилися з расчета50 мкг на 100 г маси тварини. Вивчення метаболізму нервнихклеток кори головного мозку нейтрофільних лейкоцитів щурів осуществляліспустя 6 годин після внутрішньочеревно введення досліджуваних препаратов.Результати дослідів представлені в таблицях N1 і N2.

При гістохімічному дослідженні об`єктом ізученіяслужіл ділянку головного мозку щурів, взятий в області лівої переднейцентральной звивини. Для гистохимического аналізу готували кріостатниесрези товщиною 15 мкм при -20oЗ на мікротоме- кріостатеМК-25 за загальноприйнятою методикою [9]. У клітинах кори головного мозгакрис виявляли активність лактатдегідрогенази, гліцерофосфатдегідрогеназипо методикою Гесса, Скарпеллі, Пірса [9] і сукцінатдегідрогеназипо методикою Нахласа [8]. Про активність дегідрогеназ судили поконцентраціі гранул формазану в зрізах досліджуваних об`єктів. Контрольспеціфічності гистохимического виявлення активності дегідрогеназпроводілі на кріостатних зрізах тканини мозку, які інкубіровалів робочих розчинах при відсутності в ньому специфічних субстратовокісленія. Облік гистохимической реакції на дегідрогенази осуществляліс допомогою цитофотометрія при довжині хвилі 512 нм, діаметр зонда0,1 см, об`єктив 40 [1]. Оцінку чисто хімічних реакцій оценівалів одиницях оптичної щільності. При визначенні активності дегідрогеназв нейрофільних гранулоцитах крові білих щурів досліджували актівностьСДГ [15], ЛДГ і ГФД за методом Гесса і співавт. [8] в модифікації, запропонованої Борисової М.А. і співавт. [3,4]. Цитохимические виявленіеглікогена в нейтрофільних лейкоцитах проводили за методом Хочкіса-Шабадаша [11,13]. Остаточну оцінку цитохімічної реакції осуществляліпо принципом Kaplow L. [14]. Нейтрофільні лейкоцити в зависимостиот ступеня активності ферментів класифікували:
1 ступінь - в цитоплазмі містяться поодинокі гранули формазана.Актівность ферменту незначна (мал.1а).
2 ступінь - гранули формазану займають менше половини цітоплазмиклеток. У цю групу входять клітини, що містять дрібні (пилоподібні) включення, або дуже блідо пофарбовану диффузную масу (рис.1б).
3 ступінь - лейкоцити з вираженими включеннями продуктів реакції, що займають більше половини цитоплазми нейтрофільних лейкоцитів (рис.1в).
4 ступінь - клітини з вираженими включеннями продуктів реакції, які займають всю цитоплазму нейтрофільних лейкоцитів. Актівностьфермента висока (ріс.1г). Результати досліджень обрабативаліметодамі варіаційної статистики.

Результати та обговорення.

Внутрішньочеревне введення щурам трипсину ілікаллікреіна викликало підвищення в нейроцитах і клітинах нейрогліібольшіх півкуль головного мозку активності ферменту аеробногоокісленія - СДГ на 27,2% (р lt; 0,001), на 18,2% (р lt; 0,002) відповідно. Активність ЛДГ в досліджуваних клітинах великих полушарійголовного мозку під дією трипсину і калікреїну снізіласьна 27,8% (p lt; 0,025) і на 16,3 (р lt; 0,001) соответственно.Актівность ГФД в нейроцитах і клітинах нейроглії великих полушарійголовного мозку знизилася на 26,0% (р lt; 0,01) тільки під действіемтріпсіна. Введення калликреина також викликало зменшення данногоцітохіміческого показника на 5,3% (р lt; 0,05).

Результати проведеного дослідження обобщениі представлені в таб. N1.
Вплив трипсину і калікреїну на активність дегідрогеназ в сістеменейроціт-нейроглії кори головного мозку щурів in vivo (М +/- m).

Препарати, що вводяться щурам на 100 г масиДосліджувані гистохимические показники
СДГЛДГГФД
1. Інтактні щури n = 121,94 +/- 0,051,46 +/- 0,041,29 +/- 0,08
2. 0,85% р-р хлористого натрію - 1,5 мл n = 51,96 +/- 0,251,46 +/- 0,021,25 +/- 0,08
3. Інактивований трипсин - 50 мкг n = 51,8 +/- 0,11,37 +/- 0,011,31 +/- 0,08
4. Інактивований калликреин - 50 мкг n = 51,98 +/- 0,081,54 +/- 0,021,34 +/- 0,12
5. Активний трипсин 50 мкг n = 52,29 +/- 0,05
+27,2%
*****		0,99 +/- 0,15
-27,8%
**		0,97 +/- 0,02
-26,0%
****
6. Активний калликреин - 50 мкг n = 52,34 +/- 0,04
+18,2%
****		1,29 +/- 0,05
-16,3%
*****		1,27 +/- 0,05
-5,3%
*

Примітка: в чисельнику - активність дегідрогеназв умовних едініцах- в знаменнику - зміна показника в процентахпо відношенню до контролю. Для серії дослідів N3,4 - контрольної являетсясерія N2. Для серії N5- серія N3. Для серії N6 - серія N4. (*) - Р lt; 0,05 (**) - р lt; 0,025- (***) - р lt; 0,01 (****) - р lt; 0,002- (*****) - р lt; 0,01.

Зіставлення даних гистохимического ісследованіямета-боліческіе активності клітин головного мозку і крові белихкрис при дії досліджуваних протеаз виявило однакову направленностьізучаемих показників. Парентеральне введення тваринам тріпсінаі калликреина в дозі 50 мкг на 100 г маси тіла викликало существеннийсдвіг метаболізму в системі і нейроціт-нейроглії і кори головногомозку і в нейтрофілах в бік посилення аеробних окислювально-восстановітельнихпроцессов, про що наочно свідчило збільшення актівностіСДГ, ключового ферменту окисного фосфорилювання. Учітиваяпрямое кініногеназное дію в крові трипсину і калікреїну [12], можна припустити, що виявлені нами цитохимические ізмененіяв клітинах кори великих півкуль головного мозку щурів обусловленибіологіческім дією кінінів, які, ймовірно, пронікаютчерез гематоенцефалічний бар`єр і стимулюють в нервової тканіаеробние окислювально-відновні процеси.

Зниження активності ЛДГ-ключового ферменту аеробногоокіслітельного ферменту в клітинах головного мозку і крові белихкрис при дії трипсину свідчить про те, що цей ферментпрі парентеральномувведенні пригнічує гліколіз в клітинах з разлічнойфункціональной специфічністю.

Відомо, що в порівнянні з більшістю другіхклеток організму у всіх лейкоцитах гликолитического превращеніеуглеводов превалює над окислювальним фосфорилюванням. Удельнийвес гліколізу становить понад 60% в загальній сумі енергетіческіхпроцессов [10].

Таблиця 2.
Зміни активності дегідрогеназ і вмісту глікогену в нейтрофільнихлейкоцітах білих щурів під дією трипсину і калікреїну (М +/- m) - (в умовних одиницях активності по Kaplow)

серія
дослідів		характер
впливу		Досліджувані цитохимические показники (усл.ед.)
СДГГФДЛДГглікоген
1. n = 6контроль170,0 +/- 4,0197,0 +/- 2,0195,5 +/- 10,0252,0 +/- 5,0
2. n = 6фіз.ррозчину171,0 +/- 3,0198,0 +/- 3,0196,5 +/- 5,0257,0 +/- 2,0
3. n = 6трипсин195,0 +/- 3,0164,0 +/- 3,0166,0 +/- 3,0206,0 +/- 4,0
4. n = 6калікреїн209,0 +/- 3,0160,0 +/- 2,0156,0 +/- 1,0212,0 +/- 2,0

Примітка: в кожній серії ісследованійі в контролі використано по 6 тварин. Достовірність відмінностей: р lt; 0,001.

  1. Парентеральне введення малих доз трипсину, поряд з хорошоізученнимі лікувальними властивостями, пригнічує анаеробний енергетіческійобмен нейтрофілів, гальмувати процес міграції лейкоцитів в очагвоспаленія і тим самим перешкоджає поширенню воспалітельногопроцесса.
  2. Дія малих доз трипсину збільшує антітріптіческую актівностьгомогената великих півкуль головного мозку щурів та має вираженнийлечебний антизапальний ефект.
  3. Малі дози калликреина, подібно малим дозам трипсину, сніжаютактівность ЛДГ і ГФД в нейтрофільних лейкоцитах і стімуліруютантітріпсінолітіческую активність гомогенату головного мозгакрис, що дозволяє калликреин в малих дозах, так само як і трипсин, застосовувати як протизапальний засіб.

Список літератури

  1. Агроскин Л.С., Папая Г.В. Цитофотометрія: апаратура і методианаліза клітин по светопоглощению. - Ленінград. Наука, 1979.- 259 с.
  2. Баумхакл У., Фодемар С., Крейчова Х. Ензимотерапія острихі хронічних запальних процесів в кн: Системна ензимотерапія: дослідження та клінічна практика. Під редакцією К.Ноуза, З. Масіновскі, Р. ноуз. - Мюнхен. - Прага. - 1994. - С. 27-30.
  3. Борисова М.А., Овчаренко Н.І., спагіям А.С. Деякі суправітальниеспособи цитохимического визначення активності лактатдегідрогеназиі сукцинатдегідрогенази в клітинах крові // Лаб. справа. - 1975.- N 12. - С. 723-725.
  4. Борисова М.А., Овчаренко Н.І., Шпак С.І., та співавт. Суправітальниеспособи цитохимического визначення активності альфа-гліцерофосфатдегідрогеназиі глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в лейкоцитах періферіческойкрові // Лаб. справа. - 1983. - N 9. - С. 8-10.
  5. Веселов В.Ф., Проценко В.А. Вплив ферментів протеолізу ііх інгібіторів на поглинання кисню тканинами мозку щурів і ееантітріптіческую активність // Укр. биохим. журн. - 1981. -N 4. - С. 106-108.
  6. Вольф М., Рансберг К. Лікування ферментами. - Москва: Мир, 1976.- 233 с.
  7. Діттмар Д.Ф. Аднексит в кн: Системна ензимотерапія: досліджень-ніяі клінічна практика. За редакцією К. ноуз, З. Масіновскі, Р. Ноуза. - Мюнхен. - Прага. - 1994. - С. 35-36.
  8. Пірс Е. Гистохимія теоретична і прикладна. Москва: Іностр.літер., 1962.- 962 с.
  9. Федоров Н.А. Нормальне кровотворення і його регуляція. - Москва: Медицина, 1976. - 543 с.
  10. Шабадаш А.Л. Цитологічні та цитохімічні представленіяо бар`єрних механізмах в клітинах. Праці наради в кн: Гісто-гематіческіебарьери. - Москва: Наука, 1961. - С. 381-394.
  11. Hamberg U. Influences on the kinin system by proteolysis inplasma // Proc. Roy. Sol. - London, 1969. - V. 173. - N 1032.- P. 393-406.
  12. Hotchkiss R.D. A microchemical reaction resalting in the staimingof polysaccharide structures in fixed yissue preparations // Arch. Biochem. - 1948. - V.16. - P. 131-141.
  13. Kaplow L. A histochemical procedure for localising an evacuatingleucocyte alcaline phasphatase activity in Smears of blood marrow // Blood. - 1955. - V.10. - P. 1023-1029.
  14. Klashka F. Oral enzimes - new approach to cfncer tritment // Forum. - Med. - Verl. - Ges. - 1996. -V.2.- Р. 102.
  15. Quglino D., Hayhol F. Acetone fixation for the cytochemicaldemonstration of dehidrogenase in blood and bone marrow ctlls // Nature.- 1960. -V.1.- P. 85-86.
  16. Sokolova A. Behandlung des multiplen myeloms mit enzimen // Wzarba Y., Klein M.-W., Miehlke et al. (Eds.). Sistemischeenzymtherapie. Aktueller stand and Fortschritte. - MMW MedizinVerlag. - Munchen. - Germany. - Один тисяча дев`ятсот дев`яносто шість.
95000 м Сімферополь
Бульвар Леніна 5/7
Кримський медичний університет
Кафедра патологічної фізіології
Асистент кафедри - Грановський Олександр Анатолійович
Тел: 0652-29-49-40
E-mail:[Email protected]


Поділитися в соц мережах:

Cхоже