Методи вирощування кишечника для лікування скк досягнення интестинальной тканинної інженерії

тканинна інженерія - Порівняно нова галузь досліджень, що дає надію на розробку нової тканини, яка не пов`язана з донором, не створюватиме імунологічних проблем і може бути синтезована в міру необхідності. В даний час основна увага интестинальной тканинної інженерії направлено на тонку кишку, оскільки саме вона є найбільш важливою частиною травного тракту.

Відповідно до концепцією немає необхідності відтворення нормальної довжини тонкої кишки для лікування пацієнтів з СКК. Як було зазначено раніше, більшість людей народжуються з більшою довжиною кишечника, ніж необхідно, і немовлята з СКК, як правило, мають деяку залишкову функцію тонкої кишки. Додавання невеликої кількості поглинає поверхні може бути досить, щоб дати новонародженим можливість розвиватися і рости, не будучи залежними від парентерального харчування.

перші експерименти, спрямовані на створення більшої поверхні кишки, були проведені шляхом пересадки на дефект кишки ділянки серозної поверхні з іншого відділу кишечника. Дослідники відзначили, що нова слизова росла і закривала дефект з боку порожнини. Це спонукало інших дослідників оцінити застосування штучних матеріалів в якості протеза для усунення дефекту тонкої кишки.

Оскільки спочатку використовували не розсмоктується матеріал, результати були різними. Cogan і співавт. використовували для пересадки на створений дефект клубової кишки у кроликів матеріал Dacron. Латка з Dacron зберігалася непошкодженою досить довгий час, що сприяло покриттю її новою тканиною кишки, після чого латку видаляли. В інших дослідженнях намагалися використовувати повноцінну трубку з політетрафторетилену як підсаджений (вшитого) сегмента в тонку кишку, результати показали лише незначне наростання слизової оболонки.

Перше повідомлення про використанні розсмоктується як латки було зроблено Thompson і співавт. в 1986 р .. Він і його колеги порівняли доцільність Dacron, політетрафторетилену і сітки з поліглі-Колєву кислоти в якості будівельної матриці для регенерації нової кишки. Формування нової слизової було відзначено вже через 2 тижні, через 4 тижні латки з Dacron і політетрафторетилену видаляли, а сітка з полігликолевою кислоти розсмоктувалася самостійно.

Нова слизова функціонувала, про що свідчили поглинання глюкози і активність дісахарідази. Коли між ділянками пересіченій тонкої кишки поміщали трубку з Dacron, зростання нової слизової не спостерігалося.

також було продемонстровано, що розсмоктується біоматеріал може бути використаний в якості латки на дефекти тонкої кишки. Ефективність використаного підслизового шару тонкої кишки (SIS) була продемонстрована в інших дослідженнях. SIS є бесклеточной матрицею, отриманою з тонкої кишки свиней, яку широко використовують як в експериментах по тканинної інженерії, так і в клінічній практиці.

Matsumoto і співавт. в 1966 р спочатку описали ефективність SIS як біоматеріалу, застосувавши оброблену тонку кишку для заміни великих вен у собак. Дана матриця потім була перетворена в комерційний продукт під назвою Surgisis, в даний час його випускають різної товщини і різних розмірів.

В одному з досліджень було показано, що SIS розсмоктується, а реконструйована нова кишка не відрізняється від нормальної тонкої кишки. SIS, існуючи як матриця досить тривалий час, сприяє зростанню кишки. Новостворена кишка має слизову оболонку, вариабельное кількість гладких м`язів, колагенові прошарку і зовнішній серозний покрив.

Розміщення SIS трубчастої конфігурації між розділеними сегментами тонкої кишки було невдалим. У нашому дослідженні матеріал SIS не залишив реальної цілісності, а поміщений в якості трубки або розсмоктувався, або спадався, викликаючи обструкцію. Однією з проблем виготовлення біоматеріалів для интестинальной тканинної інженерії є виробництво матриці, яка могла б тривалий час, необхідне для регенерації тканин, зберігати свою форму і структуру, а потім зникати.

Якщо біоматеріал розсмоктується або руйнується до повного завершення формування тканин, то відбувається витік внутрипросветного вмісту, що призводить до сепсису і смерті. З іншого боку, матеріал не може бути жорстким, тому що це перешкоджає накладенню анастомозов- матеріал повинен бути еластичним, щоб його можна було помістити в черевну порожнину.

Wang і співавт. відтворювали SIS-трубки довжиною 2 см від донорів-щурів лінії Sprague-Dawley і поміщали їх посередині 6-сантиметрових петель Тірі-Велли щурам лінії Lewis. Петля Тірі-Велли - це відключений сегмент клубової кишки, обидва кінці якого виведені на шкіру у вигляді стом.

Ця петля, несуча SIS-трансплантат, забезпечує опору кишці для зниження ризику ускладнень, пов`язаних з неспроможністю. Wang і співавт. також поміщали в конструкцію силіконовий стент, необхідний для підтримки форми і запобігання спадання SIS протягом процесу регенерації. Стент видаляли через 3 тижні і петлю промивали фізіологічним розчином. Формування нової слизової оболонки спостерігалося через 4 тижні, а повністю SIS-трансплантат покривався регенерованої кишкою на 12-му тижні.

зовні його покривали клітини, подібні гладком`язових клітин, а нова слизова оболонка морфологічно не відрізнялася від нормальної (з наявністю келихоподібних клітин, клітин Панета, ентероцитів і ентероендокрінние клітин). Ця цікава модель створювала захист для SIS-трансплантата і давала можливість трубчастого сегменту кишки регенерувати.

Ще одна стратегія по створенню нових тканин полягає в використанні донорської тканини в поєднанні з матричної системою в якості конструкції. Vacanti і співавт. спочатку повідомили про утворення нової кишки з подрібнених шматочків кишечника плоду в 1988 р .. Потім вони змінили початкові досліди, створивши модель для регенерації нової кишки за допомогою органоїд-полмерних структур, імплантіруя їх в сальник дорослої, половозрелой щури.

тонку кишку забирали від новонароджених щурів лінії Lewis і піддавали обробці для отримання кишкових органоїдів. Tait і співавт. відзначили, що ці органели можуть зберігатися в культурі і регенерувати. Органели, як передбачається, містять всі елементи, присутні в тонкій кишці, в тому числі стовбурові клітини, імуноцити, а також мезенхіму. Органели переносили на трубчастий біоматеріал, виконаний з полігликолевою і полімолочной кислот, потім цю конструкцію імплантували в сальник дорослої щури лінії Lewis. В результаті формувалися неоін-тестінальние кісти, забезпечені судинної ніжкою.
кісти були заповнені слизоподібною матеріалом і гістологічно були дзеркальним відображенням нормальної тонкої кишки.

Vacanti і співавт. широко використовували цю модель і продемонстрували, що кісти ідентичні нормальної кишці. Дослідники показали наявність ензимів щеточной облямівки, компонентів базальної мембрани, електрофізіологічних властивостей, а також процесів онтогенезу імунних клітин і лімфангіогенеза. Крім того, Vacanti і співавт. приступили до використання цієї моделі в лікувальних цілях, накладаючи анастомози між кістами і тонкою кишкою після масивної її резекції.

У щурів, які перенесли таку операцію, відзначалася позитивна прибавка маси тіла, і це вселяє надію, що дана модель може бути використана у дітей з СКК.

На додаток до своєї основної функції травлення і всмоктування тонка кишка є важливим імунним органом. Шлунково-кишкового тракту має найбільшу площу поверхні, на якій знаходяться більше 400 видів бактерій (в цілому 10¹⁴ мікроорганізмів). У тонкій кишці присутні приблизно 10³-10⁹ бактерій на грам внутрикишечного вмісту, а слизова товстої кишки містить 10¹¹-10¹² бактерій на грам калу. Поверхня кишки повинна створювати бар`єр для токсинів і мікроорганізмів, ефективно розпізнавати і відрізняти доброякісні комменсальние бактерії від патогенних мікроорганізмів. Якщо вторгнення патогенів відбувається, кишечник діє як імунний орган, зводячи до мінімуму несприятливого впливу і захищаючи господаря.

Оскільки регенерований кишечник повинен функціонувати як імунний орган, Vacanti і співавт. показали, що їх модель містить неоінтестінальние кісти з інтактною імунною системою в слизовій оболонці. Дослідники виявили наявність популяцій иммуноцитов, ідентичних імуноцити в нормальній тонкій кишці. Виконуючи анастомози між неоінтестінальнимі кістами і нормальної кишкою, Vacanti і співавт. показали, що вплив на слизову оболонку вмісту порожнини кишки має важливе значення для регенерації імунної системи. Дослідження неоінтестінальних кіст, залишених без анастомозів і, отже, не зазнали впливу внутрикишечного вмісту, виявило лише рудиментарную регенерацію популяцій иммуноцитов.

лабораторія Chen і співавт. також домоглася успіхів у формуванні неоінтестінальних кіст, використовуючи кишкову органоїд-полімерну структуру. Ми вирішили зосередити увагу на практичному використанні доступних на ринку біоматеріалів як матрицю для регенерації нової кишки. Серійно випускаються SIS (Surgisis®) і фібринний клей (Tisseel®) були вибрані тому, що вони являють собою два різних види біоматеріалів і легкодоступні для клінічного використання.

SIS, як зазначалося раніше, це позаклітинна матриця, отримана з кишки свиней, а фібринний клей найчастіше використовують для зупинки кровотечі, а також як засіб доставки уротеліальних і епітеліальних клітин. Хрящові структури були відтворені з хондроцитов, змішаних з фібринним клеєм.

фібринний клей складається з природних біологічних факторів, що включають фібриноген, тромбін, хлорид кальцію і інгібітор фібринолізу (апротинін). Фібринний клей являє собою ідеальний біоматеріал: він легко доставляє клітини-йому притаманні адгезивні властивості, що гарантують, що доставляються клітини адгезируются до заданої поверхні-його компоненти легко розсмоктуються і нетоксічни- внутрішні матриці формуються після того, як клей твердне в пружний згусток, зберігаючи приплив поживних речовин, а також створюючи каркас для знаходження тут клітин тривалий час-суміш клею і клітин може бути змодельована до необхідної форми. В суміші фибринного клею можуть бути присутніми деякі фактори росту, а додавання цитокінів або факторів росту в цю конструкцію для посилення тканинної регенерації - легковиполнімая процедура.

дослідження Chen і співавт. були проведені на щурах і мишах. Тонку кишку забирали у новонароджених тварин і переробляли для виготовлення кишкових органоїдів. На кожну конструкцію були поміщені 30 000-50 000 органоїдів. Вони розміщувалися на SIS, SIS плюс фібринний клей або тільки на фібрин клеї. Vacanti і співавт. в своїх дослідженнях застосовували трубчасті конструкції з полігликолевою кислоти, а у Chen і співавт. конструкції не формувалися в трубку або сферу. Конструкції Chen і співавт. з SIS або фибринного клею у формі кулі імплантували в сальник дорослих статевозрілих щурів або мишей.

Неоінтестінальние кісти визначалися через 6 тижнів, а зростання і розвиток слизової найкраще було видно через 10 тижнів. Найбільш задовільну гістологічну структуру мали кісти, які утворювалися на одному фібрин клеї або фібрин клеї з SIS. Незважаючи на відсутність трубчастої або сферичної конструкції, регенеровані кісти мали таку саму будову, як і нормальна кишка. Ангіогенез обумовлений тим, що кіста мала ніжку, пов`язану з сальником. Діаметр кіст коливався від 2 до 3 см, а деякі кісти досягали 4 см. Клітинні елементи всередині органоїдів мали можливість регулювати процес регенерації, так що кожен шар стінки кишки розташовувався в належному місці. Лінії епітеліальних клітин внутрішнього шару сформували слизову оболонку з криптами і ворсинками, слизова розташовувалася в центрі кісти, підслизовий шар був цілий, визначалися гладкі м`язи і відповідний серозний шар.

здатність кіст формуватися з кишкових органоїдів дозволяє переглянути можливості кишечника до відновлення і регенерації. Уже вивчені численні мітогени ентероцитів, які можуть бути використані для стимуляції росту нової тканини. Дійсно, Ramsanahie і співавт. спостерігали ефект GLP-2 на регенерацію неоінтестінальних кіст. GLP-2 є ендогенних регулюючим пептидом зі специфічним вираженим трофічних впливом на зростання слизової кишки і збільшенням експресії SGLT-1. Дослідники виявили, що призначення GLP-2 посилювало зростання слизової і збільшувало експресію SGLT-1, і припустили, що фактори росту можна застосувати для стимуляції регенерації нової кишки. Крім того, дослідження показало, що тканини, отримані в результаті тканинної інженерії, здатні реагувати на регулюючі чинники і можуть бути використані в якості моделі для вивчення ефектів екзогенно застосовуваних компонентів.

Перспективи вирощування кишечника для лікування синдрому короткої кишки

Незважаючи на відсутність досліджень за участю людей, можна припустити, що описана стратегія по створенню нової кишки може бути використана в лікуванні пацієнтів з синдромом короткої кишки (СКК). Одним з підходів може бути такою: тонку кишку забирають у немовляти і з неї виробляють кишкові органели. Органели ростуть і розвиваються в культурі, а потім їх поміщають на біоматеріал, наприклад фібринний клей. Потім конструкцію з органоїд-фибринного клею імплантують назад в сальник дитини, що дозволяє відтворити неоінтестінальние кісти. Далі ці кісти анастомозируют з власної кишкою. Якщо у дитини недостатня довжина кишечника, джерелом його може стати донор. Тонку кишку отримують від живого донора, який має подібний генотип. Обсяг резекції не повинен мати негативних наслідків для донора. В цьому випадку иммуносупрессия як і раніше необхідна, але терапія не буде обмежена дефіцитом донорів.

іншим потенційним підходом до лікування може стати анастомозірованіе трубчастих біоматеріалів з власної кишкою дитини, що дозволить її наростити. Для застосування біоматеріалів, наявних в даний час, сегмент кишки повинен бути взятий з власного кишечника (петля Тірі-Велли). Це дозволить утворити нову кишку на матриці, не побоюючись, що біоматеріал зруйнується до завершення процесу вростання.

Нарешті, є ще одна гіпотетична можливість накласти латку на власну кишку листом біоматеріалу для збільшення площі поверхні. Після того як це відбудеться, кишку можна подовжити, застосувавши процедуру STEP.

тканинна інженерія є порівняно новою сферою медичної науки, але результати виконаних досліджень обнадіюють. Створення нової кишки для дітей з СКК може стати реальністю в найближчому майбутньому, тому що постійно з`являються нові дані про біоматеріали, зростанні та оновленні кишечника.