Методи лабораторної діагностики. Імунологічні методи

Відео: CMD - Центр молекулярної діагностики

Імунологічні методи дослідження мають важливе діагностичне і прогностичне значення при багатьох ревматичних захворюваннях.

Вивчення неспецифічного імунітету включає в себе дослідження кількості лейкоцитів і моноцитів в сироватці крові, компонентів комплементу, оцінку рухливості, фагоцитарної і мікробіцідной активності фагоцитів, вироблення ними прозапальних цитокінів (ІЛ-ip, ІЛ-6, ФНП-а та ін.).

Збільшення рівня комплементу спостерігається при гострому запаленні, інфекційних процесах, а зменшення - при імунокомплексних захворюваннях. Так, зменшення концентрації С2 і Сз-компонентів комплементу в реакції преципітації з антисироватки характерно для ВКВ, РА, виразкової хвороби шлунку, васкулитов, неспецифічного виразкового коліту. Це пов`язано з активацією системи комплементу внаслідок утворення імунних комплексів. Діагностично значуще визначення компонентів комплементу в синовіальній рідині (вміст знижується при РА), в спинномозковій рідині (вміст знижується при волчаночном цереб-роваскуліте), в біоптатах шкіри і нирок.

Стан клітинного імунітету оцінюється кількісними показниками (абсолютне і процентний вміст Т-лімфоцитів, активних Т-лімфоцитів, Т-хелперів I типу і Т-цитотоксичних лімфоцитів) і функціональними тестами.

Найбільш часто використовують:
&diams- реакцію гальмування міграції лейкоцитів (РТМЛ) в присутності антигенів і митогенов: РТМЛ з фитогемагглютинином (ФГА), конканавалін А (КОН-А), алергенами гемолитического стрептокока, стафілокока. В основі реакції лежить властивість лімфоцитів при сенсибілізації організму до певних антигенів утворювати стабілізуючі лімфокіни, які гальмують міграцію лейкоцітов- чим вище функціональна активність лімфоцитів, тим менше показники РТМЛ;
&diams- реакцію бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ), за допомогою якої оцінюють функціональну активність Т-лімфоцитів. У відповідь на дію митогенов (ФГА), КОН-А, антилімфоцитарну сироватки та ін. Відбувається трансформація лімфоцитів в лімфобластів (чим більше утворюється бластних клітин, тим вище активність Т-лімфоцитів).
Субпопуляції Т-лімфоцитів визначають за допомогою моноклональних антитіл.

Для оцінки функціонального стану гуморального імунітету використовується кількісне визначення імуноглобулінів в плазмі крові. Імуноглобуліни (Ig) - це білки, що володіють функцією антитіл і підрозділяються на 5 основних класів: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.

IgG присутній в сироватці крові в найбільш високій концентрації (6,39-13,49 г / л), на його частку припадає 80% антитільний активності. Розрізняють 4 субкласса IgG: IgG2 (60-70%), IgG2 (20-30%), IgG3 (5-8%) і IgG4 (1-3%).

IgA є основним секреторним імуноглобуліном, виявляється в слині, сльозах, кишкових і бронхіальних секретах і материнському молоці. В секрети IgA знаходиться в вигляді димеру, що містить J-ланцюг і ще один пептид, який має назву секреторне компонентом. Концентрація IgA в нормі становить 0,7-3,12 г / л.

IgM складається з 5 мономірних субодиниць, пов`язаних дисульфідними містками і J-ланцюгом, що утворюють пентамер. Концентрація IgM в сироватці крові в нормі становить 0,86-3,52 г / л.

IgD знаходиться в сироватці в невеликій кількості, але є основним типом імуноглобулінів, присутніх на мембрані В-лімфоцитів. IgE грає важливу роль в реакціях гіперчутливості негайного типу.

Для визначення концентрації імуноглобулінів основних класів (IgG, IgM, IgA) використовують метод радіальної імунодифузії або нефелометрічеському техніку, IgE - високочутливі радіоімунологічний або імуноферментний методи.

Визначення концентрації імуноглобулінів використовують для діагностики первинних або вторинних імунодефіцитів (в цих випадках спостерігається зниження концентрації імуноглобулінів основних класів), а також моноклональних іммуноглобулінопатій (в поєднанні з іммуноелектрофореза сироватки і сечі).

Найбільш частою формою імунодефіцитів є IgA-иммунодефи-цит, розвиток якого іноді спостерігається при ревматичних захворюваннях, а також може мати місце на тлі прийому деяких лікарських препаратів (D-пеніциламін, сульфасалазина, каптоприлу та ін.). Збільшення концентрації IgA нерідко спостерігається при серонегативного спондилоартропатиях, геморагічному васкуліті, хвороби Шегрена, псоріатичний артропатії.

Часто при запальних ревматичних захворюваннях спостерігається розвиток поликлональной гіперіммуноглобулінемія.
Ревматоїдні фактори (РФ) є аутоантителами до Fc-фрагменту IgG, хоча вони можуть бути пов`язані і з IgM і IgA.

Можливо блокування ревматоїдного фактора аутологічних IgG, що веде до збільшення відсотка прихованих, комплексірованние РФ (при тривалому перебігу ревматоїдного артриту з висцеритами).

Для виявлення РФ класу М застосовуються:
&diams- реакція латекс-аглютинації з інертними частинками латексу, покритими людським Ig. Найбільше розведення сироватки, яке дає аглютинацію, вважається титром реакції. Титр 1:20 і вище розцінюється як позитивний;
&diams- реакція Ваалера-Розі з баранячими еритроцитами, сенсибілізованими кролячими антитілами проти еритроцитів барана.

Найбільше розведення сироватки, яке дає аглютинацію, діагностично значуще, якщо становить не менше 1:32.
Вівчакові (LЕ)-клітини. Наявність LE-клітин обумовлено присутністю в сироватках антитіл класу IgG до ДНК-гістонових комплексу, які реагують з ядрами, котрі звільняються з різних клітин в результаті руйнування цих клітин. LE-клітини виявляються в 60-70% випадків у хворих ВКВ. Вони являють собою зрілі нейтрофіли, фагоцитировали ядерну субстанцію зруйнованих клітин. У цитоплазмі нейтрофілів виявляються великі гомогенні включення (гематоксилінові тільця).

У випадках незавершеного фагоцитозу нейтрофіли скупчуються навколо гематоксилінові тільця в формі розетки (феномен розеткоутворення). Результат виявлення не менше 5 LE-клітин на 1000 лейкоцитів вважається позитивним. В одиничному кількості LE-клітини виявляються у 10% хворих РА, при хронічному активному гепатиті, лікарської алергії, вузликовому периартеріїт, системної склеродермії, дерматомиозите, змішаному захворюванні сполучної тканини.

Антинуклеарних антитіла (AHA) найбільш часто визначаються при ревматичних захворюваннях і зустрічаються більш ніж у 90% хворих СЗСТ. Вони являють собою сімейство аутоантитіл, взаємодіючих з рибонуклеїнова кислота і білками ядра, цитоплазматическими антигенами. Визначають AHA методом непрямої імунофлюоресценції, подвійний иммунодиффузии і контрелектрофореза, імуноферментним методом та методом иммуноблоттинга.

При використанні методу непрямої імунофлюоресценції в практичній роботі виділяють шість типів фарбування, або світіння, ядра, які важливі для діагностики системних захворювань сполучної тканини:
&diams- гомогенне забарвлення, пов`язане з наявністю антитіл до двуспиральной ДНК і гістонів, найбільш характерно для ВКВ і лікарської вовчака;
&diams- периферичний фарбування, викликане циркуляцією антитіл до ядерної мембрані (специфічно для ВКВ);
&diams- гранулярне фарбування зустрічається найбільш часто, вказує на наявність різних AHA, тому має найменшу специфічністю (відзначається при ВКВ, РА з вісцеральними проявами, змішаному захворюванні сполучної тканини);
&diams- нуклеолярное (ЯДЕРЦЕВОГО) світіння обумовлене Антитілоутворення до компонентів ядерця, зустрічається при ССД, хвороби Шегрена- зрідка АНФ виявляються при ендокринних захворюваннях (поліендокрінопатіі, цукровий діабет I типу, тиреоїдит, тиреотоксикоз), шкірних захворюваннях (псоріаз, пухирчатка), а також на тлі вагітності, після трансплантації органів і тканин (при розвитку реакції «трансплантат проти господаря»), у хворих, які перебувають на програмному гемодіалізі;
&diams- центромерная світіння відзначається при появі антитіл до Центромера хромосом (характерно для хронічного перебігу ССД);
&diams- цитоплазматическое світло означає наявність антитіл до тРНК-синтетази, зокрема Jo-1 (зустрічається при дермато- і поліміозиті).

Методами радіоактивного і імунного зв`язування, радіальної імунодифузії, иммунопреципитации виявляються AHA до окремих ядерних антигенів.

Антитіла до дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). Антитіла до нативної (двуспиральной) ДНК, особливо ті з них, які виявляються за допомогою радіоімунного тесту (метод Фарра), щодо специфічні для ВКВ. Їх визначення має суттєве значення для оцінки активності хвороби, прогнозування розвитку загострень та ефективності терапії, що проводиться. Антитіла до денатурированной (односпіральной) ДНК менш специфічні для ВКВ і часто виявляються при інших ревматичних захворюваннях.

Антитіла до гістонів. Гістони - це компоненти ядра, що складаються з трьох субодиниць: двох димарів Н2А-Н2В, які фланковані тетрамером НЗ-Н4 і асоційовані з третьої субодиницею, що складається з двох витків молекули ДНК.

Антитіла до гістонів Н2А-Н2В виявляються майже у всіх хворих з медикаментозним вовчакоподібного синдромом (індукованим новокаїнамідом), у хворих, які отримують новокаїнамід, але які не мають симптомів вовчака, а також у 20% хворих ВКВ.

Антитіла до рибонуклепротеіну (РНП). Антитіла до рибонуклепротеіну, що включають анти-Sm, анти-snRNP (U1RNP), анти-Ro / SS-A, анти-La / SS-B, сумарно зустрічаються при ВКВ частіше, ніж антитіла до двуспиральной ДНК. Концентрація цих антитіл в крові надзвичайно висока. Виявляються при змішаному захворюванні сполучної тканини, рідше - у хворих ВКВ, у яких провідним клінічним проявом є ураження шкіри, підгострому перебігу ССД та інших аутоімунних ревматичних захворюваннях.

Антитіла до Sm (Smith) -антігену. Антитіла до Sm-антигену виявляються тільки при ВКВ. За допомогою иммунофлюоресцентного методу вони виявляються в 30% випадків, і в 20% - за даними методу гемаглютинації. Антитіла до Sm-антигену не виявляються при інших ревматичних захворюваннях, тому вони розглядаються як антитіла-маркери ВКВ і їх виявлення входить в число діагностичних критеріїв цього захворювання. При наявності Sm-антитіл спостерігається більш злоякісний перебіг захворювання, ураження центральної нервової системи, вовчакові психози і відносна збереження функції нирок. Однак рівень антитіл до Sm-антигену не корелює з активністю і клінічними субтипами ВКВ.

Антитіла до Ro (Robert) / SS-A спрямовані проти ядерних рибонуклепротеіну, з якими пов`язані Yl-Y5 цитоплазматические РНК, транскрібіруемих РНК-полімераза III. Залежно від чутливості використовуваних методів дослідження антитіла до Ro / SS-A виявляються у 60-78% хворих з синдромом Шегрена, у 96% хворих на хворобу Шегрена і у 35-57% хворих ВКВ.

При ВКВ продукція даних антитіл асоціюється з певним набором клінічних проявів і лабораторних порушень: фотосенсибілізацією, синдромом Шегрена, ураженням легень, лимфопенией, тромбоцитопенією і гіперпродукцією РФ. Підвищення концентрації антитіл до Ro / SS-A в поєднанні з гіперпродукцією IgM РФ часто спостерігається при АНФ-негативному підтип захворювання (у 2-5% хворих ВКВ) - так званої підгострій шкірної вовчак.

Антитіла до La (Lane) / SS-B спрямовані проти білків, пов`язаних з транскрипт РНК-полімерази III. Антитіла до La / SS-B в більшості випадків спостерігаються спільно з антитілами до Ro / SS-A, в той час як останні можуть зустрічатися ізольовано. Антитіла до La / SS-B виявляються при хворобі і синдромі Шегрена, що поєднується з РА і ВКВ (але не з системною склеродермією), і при первинному біліарному цирозі печінки. При ВКВ антитіла до SS-B / La-антигену частіше зустрічаються на початку хвороби, що розвивається в літньому віці, і асоціюються з низькою частотою розвитку нефриту.

Антитіла Scl-70 найчастіше виявляються при дифузній формі ССД. При цьому захворюванні присутність антитіл Scl-70 в поєднанні з носійство генів HLA-DR3 / DRw52 в 17 разів збільшує ризик розвитку легеневого фіброзу. Виявлення антитіл Scl-70 у хворих з ізольованим феноменом Рейно вказує на високу ймовірність розвитку системної склеродермії.

Антіцентромерние антитіла (АСА) виявляються у 20% хворих на системну склеродермію (у більшості з них є ознаки CREST-синдрому), рідше - при первинному біліарному цирозі печінки (у половини цих хворих є ознаки склеродермії) і дуже рідко - при хронічному активному гепатиті і первинної легеневої гіпертензії. Антитіла до центромере розглядаються як прогностично несприятливий показник розвитку системної склеродермії у хворих з синдромом Рейно.

Антитіла до аміноацілсінтетазе тРНК (антісінтетазние антитіла) виявляються при наявності у хворих поліміозитом інтерстиціального ураження легень. В цілому антитіла до синтетази виявляються у 40% хворих з поліміозитом, у 54% хворих з дерматомиозитом в разі ідіопатичною форми цих захворювань і тільки у 6% хворих поліміозитом, що є одним із проявів інших ДБСТ- при пухлинному міозиті ці антитіла не виявляються. Продукція антісінтетазних антитіл асоціюється з розвитком так званого «антісінтетазного синдрому».

Антіфілаггріновие антитіла (АФА) представляють сімейство, до якого входять антікератіновие антитіла, антіперінуклеарний фактор, антитіла до Sa-антигену і недавно описані антитіла до циклічного цитрулін-який містить пептиду. За сучасними уявленнями, головною антигенною детермінантою, яка розпізнається цими антитілами, є цитрулінованого пептиди, які, зокрема, присутні в синовіальній оболонці хворих на ревматоїдний артрит (РА). АФА є високоспецифічними для РА. Найбільше застосування АФА знаходять в діагностиці раннього РА. У ряді робіт показано більш агресивний перебіг РА при наявності у хворих цих антитіл.

Антитіла до фосфоліпідів (АФЛ) - гетерогенна група аутоантитіл, що реагують з негативно зарядженими (фосфатіділсерін, фосфатидилинозитол, кардиолипин) і нейтральними (фосфатіділетаноламін, фосфатидилхолін) фосфолипидами. До них відносяться вовчаковий антикоагулянт, антитіла до кардіоліпіну і фактори, які визначають розвиток хибнопозитивної реакції Вассермана.

Вовчаковий антикоагулянт (ВА) - імуноглобуліни класів IgG та / або IgM, що пригнічують in vitro одну або кілька фосфоліпідзалежні коагуляційних реакцій, ВА розглядають як представник сімейства антитіл до фосфоліпідів, їх синтез асоціюється з розвитком венозних або артеріальних тромбозів.

Антитіла до кардіоліпіну (АКЛ). Для визначення АКЛ використовують імуноферментний метод. Продукція АКС (особливо при високих титрах АКС класу IgG), так само як і освіту ВА, асоціюється з розвитком антифосфоліпідного синдрому.

Хибнопозитивна реакція Вассермана є швидким серологічним методом діагностики сифілісу, заснованим на флоккуляции стандартної суспензії фосфоліпідів (кардиолипин) сироваткою хворого, що містить антітрепонемние антитіла (реагіни). Для більш точної діагностики сифілісу використовують метод імунофлюоресценції з трепонемним антигеном.

У 15-20% хворих ВКВ виявляється хибнопозитивна реакція Вассермана, а у 30% здорових осіб з хибнопозитивної реакцією Вассермана в подальшому розвивається ВКВ. Особливо часто хибнопозитивна реакція Вассермана виявляється у хворих з антифосфоліпідним синдромом.

Антинейтрофільні цітоплазматінескіе антитіла (АНЦА). АНЦА відносяться до сімейства аутоантитіл, спрямованих проти специфічних антигенів, присутніх в цитоплазмі нейтрофілів. Існує два типи АНЦА, які визначають за допомогою методу непрямої імунофлюоресценції при використанні фіксованих абсолютним спиртом нейтрофілів донорів. Антитіла до протеїнази III викликають дифузне (класичне) цитоплазматическое світіння і позначаються як до-АНЦА або ц-АНЦА. Антитіла до мієлопероксидази, еластаза та лактоферину характеризуються перінуклеарним типом світіння і позначаються як перинуклеарний або п-АНЦА. АНЦА часто виявляються при системних васкулітах.

Стрептококова інфекція викликає збільшення титрів антистрептококових антитіл. Визначення антистрептококових антитіл використовують для діагностики гострого ревматизму (гострої ревматичної лихоманки) і гострого гломерулонефриту.

Найбільшого поширення набуло визначення антитіл до стрептолізин О (АСЛ-О), стрептокінази (АСК) і стрептодезоксірібонуклеазе В (анти-ДНКаза В). Збільшення титрів АСЛ-О виявляється більш ніж у 2/3 хворих з гострою ревматичної лихоманкою і тільки у половини хворих на гострий гломерулонефрит. Максимальні титри антистрептококових антитіл виявляються в період розвитку поліартриту, а під час розвитку кардиту або хореї титри цих антитіл значно зменшуються, що знижує діагностичну цінність даного тесту.

Важливе значення для діагностики мають реакції визначення антитіл після перенесених інфекцій: реакція Вассермана, реакції зв`язування комплементу з туберкульозним, псевдотуберкулезних, іерсініозной, шигеллезной і іншими антигенами, HBs-антигенами, гонококковим (реакція Борде-Жангу) і бруцеллезним (реакція Райта-Хеддльсона) антигенами , титр антихламідійний антитіл.

Кріоглобуліни - група сироваткових білків, що володіють аномальною здатністю до оборотної преципітації або утворення гелю при низькій температурі. Кріоглобуліни можуть виявлятися при різних захворюваннях внутрішніх органів, в тому числі дуже часто при системних ревматичних хворобах.

Залежно від складу кріоглобуліни поділяють на три основні типи. Тип I складається з моноклональних імуноглобулінів IgA або IgM, рідше - моноклональних легких ланцюгів (білок Бенс-Джонса). Тип II (спостерігається при так званій змішаній криоглобулинемии) складається з моноклональних імуноглобулінів (зазвичай IgM, рідше - IgA або IgG), що володіють антіглобуліновой активністю проти поліклонального IgG. Тип III (спостерігається при так званій змішаній криоглобулинемии) складається з одного або декількох класів поліклональних імуноглобулінів. Найчастішою формою криоглобулинемии при ревматичних захворюваннях є тип III Він зустрічається при ВКВ, РА, системної склеродермії, синдромі Шегрена.

Циркулюючі імунні комплекси (ЦВК). Збільшення концентрації ЦВК відображає запальну і імунологічну активність патологічного процесу при ВКВ, РА, серонегативних спондилоартропатиях.

В.І. Мазуров