Гематологія-вплив нових активностей мутантних р53 на клітинний цикл, апоптоз і чутливість до цитостатикам

Пухлинний супресор р53 є центральним компонентом внутріклеточнойохранной системи, що запобігає розмноження і накопичення в організмеаномальних клітин. До р53 ведуть численні сигнальні шляхи, распознающіеразлічние внутрішньоклітинні зміни, такі як пошкодження ДНК, недолік пулу нуклеотидів, гіпоксія, теплової та холодової шок, вірусна інфекція, експресія активованих онкогенів, разрушеніяцітоскелета і т.д. Дія цих чинників призводить до стабілізаціір53, зміни його конформації і переходу в функціонально актівноесостояніе. Будучи транскрипційним фактором, активоване р53ізменяет експресію ряду генів-мішеней, продукти яких регуліруютпродвіженіе по клітинному циклу (p21WAF1, Gadd45, 14-3-3s, jqклінВ і ін.) І апоптоз (Bax, Bcl2, PIG3, Fas, Killer / DR5 і ін .). У результатеактівація р53, що викликається різними внутрішньоклітинними змінами, призводить або до зупинки клітинного циклу у G1 і G2 фазах, лібок загибелі клітини. Таким чином, р53 виконує найважливішу охраннуюфункцію, здійснюючи вибракування аномальних і потенційно опаснихклеток. Порушення функції р53 різко збільшують ймовірність развітіяновообразованій. Так, вроджені мутації р53 викликають синдром Лі-Фраумені, що характеризується розвитком в молодому віці множинних первічнихопухолей.

Порушення функції р53 є найбільш універсальним молекулярнимізмененіем в різних новоутвореннях людини. Вони можуть вознікатьлібо ще в нормальній клітині і збільшувати таким чином вероятностьобразованія з неї неопластического клону, або відбуватися ужев пухлинних клітинах і детермінувати подальшу прогресію новообразованія.Следует підкреслити, що, змінюючи регуляцію Чекпойнт клеточногоцікла і апоптозу, порушення функції р53 модифікують чувствітельностьклеток до протипухлинних препаратів.

Як правило, в пухлинах виявляються міссенс-мутації р53, пріводящіек заміні однієї з амінокислот на іншу, причому з найбільшою частотоймутаціі зустрічаються в трьох "гарячих точках": Кодонах175, 248 і 273. Ймовірно, експресія мутантного р53 надає клеткедополнітельние селективні переваги в порівнянні з клітинами, в яких зміни в гені р53 призводять просто до втрати експрессііповрежденного алелі. Цей факт може пояснюватися, по крайнеймере, двома причинами. По-перше, мутантний білок володіє домінантно-негатівнимеффектом щодо білка дикого типу, тобто точкова мутаціядаже в одному з двох алелей здатна повністю придушити охраннуюфункцію р53. По-друге, останнім часом з`являються дані, що вказуватимуть існування у мутантних форм р53 новопридбаних активностей ("gain-of-function"). Відомо, наприклад, що за счеттакіх активностей мутантний р53 може специфічно і з високойаффінностью зв`язуватися з МАR / SАR ДНК-елементами, викликаючи ремоделірованіехроматіна, транс-активувати промотори ряду генів (онкогена myс, рецептора епідермального фактора росту та ін.), А також увелічіватьметастатіческій потенціал пухлинних клітин. Однак молекулярниеоснови новопридбаних активностей і їх роль в процесах канцерогенезапока практично не вивчені.

Ми зробили спробу дослідити вплив знову пріобретеннихактівностей мутантного р53 на регуляцію клітинного циклу, апоптозаі чутливості до цитостатикам. Для цього були вивчені еффектимутантних р53 з амінокислотними замінами в кодонах 175, 248 ілі273, є "гарячими точками" мутацій в разлічнихопухолях людини. Нові активності мутантних р53 виявляється шляхом трансдукції в культивовані in vitro клітини, що не продуцірующіеендогенний р53. Використання клітин, в яких відсутня експрессіяендогенного р53, дозволяло виключити прояви домінантно-негатівногоеффекта і досліджувати дію тільки новопридбаних актівностейтрансдуцірованного мутантного р53.

Нами були отримані і проаналізовані похідні клітин мишіі людини з конститувною або тетрациклін-репресованих експрессіейекзогенного р53. В останньому випадку експресія мутантного р53подавлялась додаванням в культуральне середовище тетрацикліну (1мкг / мл). Через 24-48 год після переведення отриманих нами сублінійклеток в середу без тетрацикліну спостерігається індукція експрессііекзогенного мутантного р53, що не супроводжується підвищенням експрессіігенов-мішеней р53 дикого типу (p21WAF1 і ін.).

Вплив нових активностей мутантних р53 на клітинний цикли швидкість проліферації клітин

Знов придбані активності мутантного р53 викликають существенноеувеліченіе швидкості проліферації клітин. Так, введення вектора, конститутивно експресує мутантний р53-His175, повишаетскорость розмноження р53-негативних мишачих фібробластів лініі10 (3) приблизно в 1,5 рази: в логарифмічній фазі росту времяудвоенія клітинної популяції зменшувалася з 23,5 год до 16 год. Сходнаякартіна спостерігалася і в разі тетрациклін-регульованої експрессіір53-His175 в клітинах людського карциноми легені лінії Н1299ілі мишачих фібробластах лінії 10 (1), що підтверджувало связьвиявленних відмінностей в швидкості проліферації саме з експрессіеймутантного р53, а не з якимись вторинними змінами, вознікающімів результаті тривалої селекції клітин з екзогенних мутантнимр53. Слід підкреслити, що індукція експресії р53 дикого типу цих клітинних контекстах наводила до зменшення, а до увеліченіювремені подвоєння клітинної популяції або до апоптозу.

Прискорення розмноження клітин під впливом знову пріобретеннихактівностей мутантного р53 обумовлено, мабуть, їх воздействіемна регуляцію клітинного циклу. Аналізуючи кінетику появи меченихмітозов після додавання 5-бромдезоксіурідіна на 20 хв., Ми определяліпродолжітельность окремих фаз клітинного циклу в логаріфміческойфазе зростання. Виявилося що, включення експресії мутантного р53значітельно зменшує час проходження клітинного циклу за счетсущественного укорочення тривалості S-фази. При цьому мутантнийр53 не чинив істотного впливу на тривалість другіхфаз клітинного циклу.

Знов придбані активності мутантного р53, крім ізмененійрегуляціі клітинного циклу при нормальних фізіологічних умовах, можуть модифікувати функцію G1-Чекпойнт, який активується повреждающімівоздействіямі. Ми виявили, що індукція експресії мутантногор53-His175 в клітинах 10 (1) і Н1299 призводить до того, що в S-фазувходіт в 1,5-2 рази більше клітин з ушкодженнями ДНК, індуцірованниміалкілірующім з`єднанням етилметансульфонату (ЕМС), тоді какекспрессія р53 дикого типу, навпаки, зменшує частку поврежденнихклеток, що входять в S-фазу. У той же час р53-His175 практіческіне впливає на активність Чекпойнт, що оперує в G2.

Механізми виявлених нами ефектів новопридбаних актівностеймутантного р53 щодо регуляції клітинного циклу поки неясни.Наіболее вірогідним є припущення про те, що ці ізмененіясвязани зі здатністю р53-His175 збільшувати експресію генаmyc. Його продукт, як було показано раніше, може, з одного боку, транс-активувати ген орнітин-декарбоксилази і викликати, в такий спосіб, вкорочення S-фази, а з іншого боку активувати комплексиціклін E / Cdk2 і скасовувати зупинку пошкоджених клітин при переходеіз G1 в S .

Вплив нових активностей мутантних р53 на індукцію апоптозу

Мутантні р53 можуть модифікувати дію цитостатиків, ізменяяне тільки регуляцію G1-Чекпойнт, але і послаблюючи індукцію апоптоза.Прі цьому, нові активності мутантного р53 впливають як наапоптоз, що викликається ушкодженнями ДНК, так і на апоптоз, індукований"доменами смерті" ("death receptors") Последобавленія в культуральне середовище TNF-a або антитіл до Fas. Следуетподчеркнуть, що такі ефекти мутантних р53 в значній степенізавісят від конкретної амінокислотною заміни, типу апоптозу і, можливо, клітинного контексту. Так, p53-His175, значно сильніше, ніж p53-Trp248 або p53-His273, пригнічує апоптоз, викликаний ДНК-повреждающімівоздействіямі (ЕМС, етопозид). У той же час p53-His273 сильніше, ніж p53-His175, пригнічує Fas-індукований апоптоз в человеческіхклетках раку простати лінії РС-3. Крім того, різні мутантниер53 диференційно впливають на апоптоз, індукований Fasі TNF-a.

Механізми дії новопридбаних активностей мутантнихр53 на регуляцію апоптозу досліджені поки досить погано. Недавнообнаружено, що одним із шляхів такого регулювання може являтьсятранс-активація гена BAG1, що кодує антиапоптотический белоксемейства Bcl2.

Вплив нових активностей мутантних р53 на чувствітельностьк хіміопрепаратів

Крім неспецифічного впливу на чутливість до цітостатікампосредством зміни регуляції клітинного циклу та апоптозу, новиеактівності мутантних р53 можуть надавати і більш спеціфіческоедействіе на чутливість до певних лікарських средствампутем зміни регуляції мішеней хіміопрепарата. Використовуючи методсубтрактівной гібридизації ми ідентифікували невідомі ранеемішені трансактіваціонного дії мутантних р53 і виявили, що в групу генів, специфічно активуються мутантними р53, входить ген, що кодує дезокси-УТФ-азу. Функція дУТФази заключаетсяв гідролізі дУТФ до дУМФ і пірофосфату. У свою чергу, дУМФ служітсубстратом для освіти дТТФ de novo. Передбачається, що повишеніеуровня дУТФази може викликати стійкість до 5-фторурацилу, Широко застосовується хіміопрепаратів, механізм дії якого связанс пригніченням синтезу дТТФ шляхом придушення активності тіміділатсінтетази.Ми виявили, що індукція експресії р53-His175 або p53-His248, також як і введення конструкту, експресує УТФ -азу, вовсех досліджених нами культурах (карцинома легкого H1299, ракяічніка SKOV-3, фібробласти 10 (1) в 1,5-2 рази збільшувала чіслоклеток, здатних утворювати колонії після впливу 5-фторураціла.Прі цьому стійкість до двох інших препаратів - метотрексатуі адріаміціном - не збільшувалася. У той же час р53-His273, необладающій здатністю транс-активувати ген УТФ-ази, що не увелічівалустойчівость даних клітинних культур до 5-фторурацилу.

Очевидно, існують й інші шляхи, за допомогою яких вновьпріобретенние активності мутантних р53 впливають на чувствітельностьклеток до тих чи інших цитостатикам. Так, ми виявили, що влейкозних клітинах лінії К562, на відміну від клітин 10 (1) і ін., Експресія p53-His175 викликає суттєве зменшення чувствітельностік метотрексату. Експресія цього мутанта кілька увелічівалатакже стійкість лейкозних клітин до дії винбластина, нопрактіческі не міняла чутливості до етопозиду. У той же час, експресія p53-His273 не знижувати, а, навпаки, кілька повишалачувствітельность клітин К562 до метотрексату і вінбластин. Механізмиетіх ефектів залишаються неясними.

Таким чином, ми виявили, що знову придбані актівностімутантних р53 з амінокислотними замінами в різних положеннях разлічнимобразом впливають на чутливість до різних хіміопрепаратів. Прицьому можуть відрізнятися не тільки ефекти різних мутантних р53 водному і тому ж типі клітин, а й дію одного і того ж мутантав клітинах різного походження. Все це необхідно учітиватьпрі на нинішні спроби іспользоватьмутаціі р53 для передбачення результатів протипухлинної хіміотерапії.