Онкологія-

Б.П.Копнін

Російський онкологічний науковий центр ім. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

джерело RosOncoWeb.Ru

01 0203 0405 0607
3.2. pRb - перший ідентифікований пухлинний супресор

3.2.1. Відкриття гена Rb

Ідентифікація пухлинних супресорів почалася з виявлення генаRb, вроджені мутації якого викликають розвиток ретінобластом.В початку 1970-х р.р. Кнудсон, проводячи епідеміологічні дослідження, зазначив, що близько 40% ретинобластом виникає в младенческомвозрасте (середній вік 14 місяців). Причому ці пухлини какправіло білатеральні (виникають з сітківки обох очей) і частомножественние (в середньому по 3 незалежні пухлини на пацієнта) .Якщо такі пацієнти в результаті хірургічного вмешательстваізлечівалісь від ретинобластом, у багатьох з них в юнацькому возрастеразвівалісь остеосаркоми, а в зрілому віці - меланоми кожі.Прі цьому в багатьох випадках відзначався спадковий характер заболеванія.Кнудсон сформулював гіпотезу, згідно з якою, якщо діти наследуютмутантний аллель гена, пізніше названого Rb, то друга мутація, яка відбувається вже в ретінобластом, веде до виникнення опухолі.Ето досить часта подія (відбувається приблизно у 95% паціентовс частотою близько трьох на пацієнта) і, тому, предрасположеніек розвитку хвороби має домінантний характер успадкування. Кнудсонпредположіл також, що діти, у яких ретинобластоми вознікаютв більш пізньому віці (частота таких пухлин невелика - 1на 30000 індивідуумів), не успадкують мутантний аллель гена Rb.Вместо цього у них відбуваються дві незалежні мутації в одноміз ретінобластом, що і призводить до розвитку пухлини. Отже, відповідно до гіпотези Кнудсон, у першої групи пацієнтів імеетсяодна вроджена і одна придбана мутації, тоді як у второйгруппи хворих обидві мутації придбані.

Так як при деяких спадкових ретинобластома обнаружівалісьнебольшіе делеции ділянки довгого плеча хромосоми 13 (13q14), було припущено, що ген "схильності до ретинобластоме"(Rb) локалізується саме в цій ділянці геному. І дійсно, за допомогою позиційного клонування був ізольований ген, обидва аллелякоторого інактивовані в клітинах як спадкових, так і спорадіческіхретінобластом. При цьому при спадкових формах заболеваніявсе клітини організму мали вроджені мутації цього гена. Такимобразом, стало ясно, що постуліруемие Кнудсон дві мутації, необхідні для розвитку ретинобластом, відбуваються в різних аллеляходного і того ж гена Rb. Інактивація гена Rb була обнаруженане тільки в ретинобластома, але і в клітинах деяких інших, неспадкових новоутворень: практично у всіх случаяхмелкоклеточного раку легкого, частини випадків (20-40%) гострого лейкозу, остеосаркоми, раку сечового міхура, простати та ін. Восстановленіеекспрессіі цього гена в культивованих in vitro клітинах ретинобластома остеосарком призводило до гальмування їх росту. Таким чином, вперше були отримані вагомі докази існування генів, повна інактивація яких призводить до розвитку новообразованійі продукти яких здатні придушити розмноження неопластіческіхклеток. Закономірності, виявлені при дослідженні гена Rb, зокрема асоціація зі спадковими формами пухлин і необходімостьпораженія обох алелей (рецесивний характер прояви мутацій), стали використовуватися в якості критеріїв при пошуку і ідентіфікаціідругіх пухлинних супресорів.

В даний час досягнуто значного прогресу в поніманіінормальной функції продукту гена Rb (pRb) в клітці, охарактерізованитіпи і місце розташування мутацій в гені Rb при ретинобластома идругих новоутвореннях, запропоновані високоефективні методи скрінінгамутацій Rb у індивідуумів в групах ризику.

3.2.2. Функція pRb в клітці і її порушення при канцерогенезі

pRb є фосфобелок c мовляв. масою 105кД, локалізующійсяв ядрі і експресується в більшості типів клітин. Він дефосфорілірованв неделящихся клітинах, а також в проліферуючих клітинах, находящіхсяв початку G1 фази клітинного циклу. В такому стані pRb образуеткомплекси з рядом білків, в тому числі з білками, що викликають ремоделірованіехроматіна (гістонові деацетілази HDAC, комплекси SWI-SNF) і транскріпціонниміфакторамі сімейства E2F, що регулюють активність генів, продуктикоторих необхідні для початку і проходження S-фази (циклин Е, циклин А, дигідрофолатредуктазу, тимідинкіназа, PCNA, ДНК-полімеразаa і ін). Транскрипція цих генів пригнічена, якщо E2F пов`язаний скомплексамі HDAC / pRb / SWI-SNF. При мітогенних сигналах pRb в середінеG1 фази фосфорилируется за певними амінокислотним остаткамціклінзавісімой кінази циклін D / Сdk4 (6), що викликає отвязиваніеот нього HDAC. Комплекс pRb / SWI-SN (без HDAC) не блокує способностьE2F транс-активувати ген цикліну E, але репресує транскріпціюдругіх E2F-регульованих генів, зокрема цикліну А. В результаті наприкінці G1 фази відбувається виборча активація ціклінзавісімойкінази циклин Е / Cdk2, яка додатково фосфорилирует pRbпо іншим амінокислотним залишкам. Це викликає висвобожденіетранскріпціонного фактора E2F з комплексів з pRb / SWI-SNF і егоактівацію, що приводить до підвищення експресії циклін А і другіхгенов, продукти яких необхідні для синтезу ДНК (Рис. 1).

Мал. 1. pRb регулює активність транскрипційних факторів семействаE2F і циклінзалежної киназ, відповідальних за вхід і продвіженіепо S фазі клітинного циклу (пояснення в тексті).

Після завершеніяS фази pRb переходить в дефосфорілірованний стан, в которомон блокує активність E2F і вхід в наступну S фазу (для її ініціаціінеобходім новий мітогенний стимул, який активує комплекси ціклінD / Cdk4). Таким чином, модулюючи активність E2F і регуліруемихім генів, pRb грає ключову роль в контролі последовательностісобитій, що забезпечують перехід клітини з G0 / G1 в S фазу і її успешноезавершеніе. На додаток до E2F pRb пов`язує і модулює актівностьряда інших транскрипційних факторів, більшість з яких тканеспеціфічниі беруть участь в регуляції певних дифференцировочного программ.Так, він збільшує транскрипционному активність деяких представітелейсемейства bHLH (MyoD і ін.), Які стимулюють м`язову діфференціровкуі сімейства C / EBP, що грають ключову роль в моноцитарно-макрофагальної (NF-IL6) і адіпоцітарной (C / EBP-b) диференціювання. Крім того, pRb пов`язує і репресує гомеобокс-містять транскріпціонниефактори (Pax-3, Mhox, Chx10), що визначають долю клітини в раннемембріоненезе. Все це дало підставу вважати, що основна фізіологіческаяфункція pRb полягає в детермінування деяких термінальнихдіфференціровок, для чого необхідна зупинка клітинного циклу (здійснюється за рахунок пригнічення функції E2F) і індукція експрессііряда спеціалізованих білків (реалізується шляхом модифікації актівностітканеспеціфічних транскрипційних факторів). Значна частьмутацій гена Rb, які виявляються в різних пухлинах, викликають лібоделецію гена, або зсув кодує рамки, або її преждевременнуютермінацію, або порушення сплайсингу мРНК. Все це призводить Ілик повної втрати експресії білкового продукту, або до експрессіінеполноценних і нестабільних білків pRb. У частині випадків наблюдаютсяміссенс-мутації, що викликають заміну одного з амінокислотних остатков.Такіе мутації вражають домен, відповідальний за зв`язування pRb cрядом клітинних білків і вірусними онкобелкамі - T-SV40, E1A аденовірусові E7 HPV. Мабуть порушення функції саме цього домену, визиваемоелібо мутаціями, або його зв`язуванням з вірусними онкобелкамі, являетсякрітічним для придушення супрессорной активності pRb. При мутаціяхобоіх алелей гена Rb, що викликають відсутність в клітці білка pRbілі експресію його функціонально неактивної форми, транскріпціоннийфактор E2F знаходиться в перманентно активованому стані. Це, по-перше, зменшує залежність розмноження клітин від ростовихфакторов, а по-друге, скасовує негативну регуляцію клітинної проліферацііпрі зростання-інгібуючих сигналах. Крім того, втрата функції pRb нарушаетпроцесси клітинної диференціювання. Все це різко збільшують вероятностьпоявленія постійно пролиферирующих клонів клітин, в яких будутнакапліваться і інші онкогенні мутації, що ведуть до злокачественнойтрансформаціі. При цьому, поки залишається неясним, чому при врожденнойінактіваціі одного з алелей гена Rb у всіх клітинах організмау пацієнта в юному віці розвивається саме ретинобластома, ане якісь інші новоутворення. Цікаво, що у трансгеннихмишей з інактивацією одного з алелей гена Rb (інактивація обоіхаллелей несумісна з життям ембріонів через порушення ерітропоезаі нейрогенеза) виникають не ретинобластоми, а мозкові раки щитовидноїзалози або аденоми середньої частки гіпофіза, що виникають з меланофорів (на відміну від мишей у людини ця тканина в гіпофізі атрофована) .Більше того, ретинобластоми не розвиваються і у химерних мишей, вовсех клітинах сітківки яких інактивовані обидва алелі гена Rb.Отсутствіе ретинобластом у таких химерних мишей може бути об`ясненоотносітельно невеликим, порівняно з людиною, кількістю клетокв сітківці, що зменшує ймовірність виникнення протягом короткойжізні тварини в одному з ретінобластом додаткових генетіческіхізмененій, необхідних для розвитку новоутворення. Менша вероятностьтакіх подій може бути також пов`язана з відсутністю у лабораторнихмишей додаткових канцерогенних факторів, таких як облученіеклеток сітківки сонячним світлом, що сприяє, очевидно, развітіюретінобластом в аналогічній ситуації у людини. На користь предположеніяо необхідності для розвитку ретинобластом дополнітльние собитійможет свідчити той факт, що ретинобластоми виникають утрансгенних мишей, які експресують вірусний онкобелок T-SV40, которийсвязивает і інактивує не тільки pRb, але і його гомологи (див. Нижче), а також іншої пухлинний супресор - р53 (див. розділ 3.3).

3.2.3.Гомологі pRb: p107 і Rb2 / p130

Трохи пізніше, на початку 90-х гг.било ідентіфіціоровано два гена, продукти яких, білки р107 іRb2 / p130, мають структурну схожість і частково перекривающіесяфункціі з pRb. Так, подібно pRb, вони здатні пригнічувати актівностьE2F-респонсівних генів і блокувати вхід в фазу S. Разом з тим, вони мають ряд відмінностей від pRb. Зокрема, вони пов`язують толькоE2F4 і E2F5, тоді як рRB взаємодіє з E2F1, E2F2, E2F3 іE2F4. Можливо тому р107 і Rb2 / p130, на відміну від pRb, що не способниподдержівать тривале перебування в G0 та диференціювання некоторихтіпов клітин, наприклад міоцитів. Порушення функції гомологів pRb, мабуть, не причетні до ініціальним етапах розвитку будь-лібоопухолей людини, так як поки не виявлені спадкові форминовообразованій з вродженими гермінальних мутаціями генів р107ілі Rb2 / p130. Крім того, у мишей з гетерозиготних нокаутом етіхгенов частота виникнення пухлин не підвищується. У той же времясоматіческіе инактивирующие мутації гена Rb2 / p130 характерні длячасті випадків лімфоми Беркита, раку носоглотки і мелкоклеточногорака легкого, причому, як правило, вони виявляються на пізніх стадіяхзаболеванія. Ймовірно, порушення функції цього гомолога pRb обеспечіваютпрогрессію деяких новоутворень.