Онкологія-

Б.П.Копнін

Російський онкологічний науковий центр ім. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

джерело RosOncoWeb.Ru

01 0203 0405 0607
3.3. р53 - багатофункціональний пухлинний супресор, частіше всегопоражаемий в різних новоутвореннях людини

3.3.1. Типи пухлин, асоційовані з аномаліями р53

Найбільш універсальним молекулярним зміною в різних новообразованіяхчеловека є інактивація функції білка р53. Більш ніж в половіневсех пухлин людини (50-60% новоутворень більш ніж 50 разлічнихтіпов) виявляються мутації гена р53. На відміну від інших опухолевихсупрессоров, для яких характерні мутації, котрі припиняють сінтезбелка (делеції, освіту стоп-кодонів, зрушення кодує рамки, порушення сплайсингу мРНК), переважна більшість (понад 90%) мутацій р53 є міссенс-мутації, що призводять до заменеодной з амінокислот в білкової молекулі на іншу. Ще однойособенностью мутацій р53 в пухлинних клітинах є те, щовони, на відміну від мутацій інших пухлинних супресорів, частоявляются гетерозиготних, тобто вражають тільки один з двох аллелейгена. (Причини цих відмінностей будуть розкриті нижче, при рассмотренііструктурной організації і функцій р53 - див. 3.3.2.)

Мутації виявляються в різних ділянках молекули р53, але частіше всього в його еволюційно консервативному ДНК-зв`язує домені, причому з найбільшою частотою в кодонах 175, 245, 248, 249, двісті сімдесят третій 282 (так звані гарячі точки) - див. Рис. 2. Цікаво, що спектр мутацій дещо змінюється в залежності від гістогенезаопухолі і / або етіологічного фактора. Наприклад, мутації в кодоне175 невідомі в пухлинах легенів, а заміни в інший горячейточке - кодоне 273 - не виявляються при владний криз хроніческогоміелоідного лейкозу. У той же час для раків легкого характернимутаціі в кодоні 145, дуже рідко зустрічаються в інших новоутвореннях, а мутації в кодоні 249 виявляються переважно в гепатокарціноми, викликаних специфічним канцерогеном - афлатоксином В. Очевидно, відображенням дії канцерогенів з різними механізмами мутагенногодействія є і відмінності в характері мутацій р53 в різних опухолях.Так, при пухлинах легень, печінки і лімфоми заміна амінокіслотнихостатков в більшості випадків зумовлена трансверсії (в ДНКпуріновий нуклеотид замінений на піримідинові або навпаки), Апрі карцинома шкіри, лімфомі Беркітта, Т-клітинному лейкозі - транзіциі (заміною пуринового підстави на інше пуриновое або пірімідіновогона інше пиримидиновое).

Гермінальних (що відбулися в статевій клітині і передаються понаследству) мутації в одному з алелей гена р53 викликають сіндромЛі-Фраумені, що полягає у природженому нахилі до развітіюразлічних новоутворень, в першу чергу сарком, раку молочноїзалози, лімфолейкоз. Нерідко синдром Лі-Фраумені характерізуетсявознікновеніем первинно-множинних пухлин. Примітно, що у трансгенних мишей із инактивирующие мутації в генер53, спостерігається картина, дуже нагадує синдром Лі-Фраумені.Прімерно у третини тварин, у яких инактивирован один з двухаллелей р53, протягом 6-9 місяців після народження виникають новоутворення, причому їх спектр дуже схожий зі спостережуваним при синдромі Лі-Фраумені.Прі цьому в частині цих пухлин, як і новоутворень у паціентовс синдромом Лі-Фраумені, зберігається експресія неповрежденногоаллеля гена р53. При вродженої інактивації у всіх клітинах організмаобоіх алелей гена р53 пухлини розвиваються практично у всехжівотних. Приблизно така ж картина спостерігається у трансгеннихмишей, несучих додатковий екзогенний аллель р53, кодірующійбелок з міссенс-мутацією.

Важливо підкреслити, що мутації - не єдиний шлях нарушеніяфункціі білка р53 в пухлинних клітинах. Так, для 10-20% раку молочноїзалози, а також для нейробластом характерно порушення транспортар53 з цитоплазми в ядро, де він проявляє свою функціональнуюактівность. У частині остеосарком спостерігається ампліфікація клеточногоонкогена MDM2, продукт якого пов`язує і інактивує белокр53 (див. Розділ 3.3.3). При раку шийки матки, ассоціірованномс вірусами папілом людини, відбувається зв`язування р53 з віруснимонкобелком Е6), що викликає деградацію білка р53, і т.д.

3.3.2. Структурна організація і біохімічні активності белкар53

Продукт гена р53 має мовляв. масу 53кДа і складається з 392 амінокіслотнихостатков. Він утворює тетрамерний комплекс, здатний регуліроватьтранскріпцію ряду генів, що мають в своєму складі спеціфіческіепоследовательності ДНК, так звані р53-респонсівние елементи.В молекулі р53 картіровано кілька функціонально-значущих доменів, що грають важливу роль в здійсненні або регуляції його активності (Рис. 2).

N-кінцева ділянка (амінокислоти 1-42) являє собою домен, відповідальний за транскрипционному активацію генів-мішеней. Онобладает здатністю зв`язуватися з компонентами базальних факторовтранскріпціі, зокрема з субодиницями hTAFII31, hTAF70 комплексаTFIID РНК-полімерази II, а також з транскрипційним кофакторомp300 / CBP. Крім того, цей домен бере участь в білок-білкових взаємодіях, що регулюють стабільність молекули р53. І, нарешті, в ньому расположенонесколько залишків серину і треоніну, фосфорилирование которихрегулірует активність р53.

Мал. 2. Схематичне зображення функціональних доменів р53, передбачуваної моделі придбання білком транскрипційно актівнойконформаціі і частоти виникнення в новоутвореннях человекамутацій в різних ділянках молекули р53.

Центральний домен р53 (амінокислоти 120-290) непосредственноузнает і пов`язує специфічні послідовності ДНК регуліруемихгенов, так звані р53-респонсівние елементи, що складаються ізрасположенних один за одним послідовностей з обобщеннойструктурой типу PuPuC (A / T) (A / T) GPyPyPy (Pu - пурин, Py - піримідин) .Саме в цьому ДНК-зв`язує домені локалізується большінствоточечних мутацій, що виявляються в різних пухлинах людини (Рис. 2).

Далі йдуть ділянки відповідальні за ядерну локалізацію (амінокіслоти305-323) і дімерізацію / тетрамерізацію молекул р53 (амінокіслоти323-356). З-кінцева ділянка р53 (амінокислоти 363-392) представляетсобой так званий інгібіторний домен. У немодіфіцірованномсостояніі він перешкоджає посадці ДНК-зв`язуючого домену на спеціфіческуюпоследовательность регульованого гена. Фосфорилювання і ацетілірованіеего певних сайтів викликають зміни конформації белковоймолекули і перехід тетрамеров р53 з неактивного (латентного) стану в активне. В результаті ДНК-зв`язуючі домени освобождаютсяот блокуючого впливу інгібіторних доменів і набувають способностьсадіться на р53-респонсівние елементи. Таким чином, до респонсівнимгенам залучаються базові фактори транскрипції, связивающіесяс N-кінцевим ділянкою р53, і стимулюється синтез РНК генів-мішеней.

Крім підвищення транскрипції генів, що містять спеціфіческіереспонсівние елементи, білок р53 має також і рядом другіхактівностей. Зокрема, він здатний пригнічувати транскрипцію багатьохінших генів, наприклад протоонкогенов BCL2, JUN і FOS, гена фібронектінаі т.д. В основі такої транс-репресії лежить кілька механізмів: зв`язування і секвестрація активованим р53 ряду базових факторовтранскріпціі (p300 / CBP, TBP, CBF) - здатність зв`язувати і рекрутіроватьк певним генам гістонові деацетілази (HDAC), ремоделірующіехроматін- і т.д. Крім того, р53 зв`язується з білками, вовлеченнимів реплікацію або репарацію ДНК і, як наслідок, модулює етіпроцесси. Так, взаємодіючи з білком RP-A, він пригнічує егоспособность активувати ДНК-полімерази a і d, результатом чегоявляется придушення реплікації ДНК. Пов`язуючи компоненти комплексаTFIIH (ERCC2, ERCC3 і ін.), Р53 активує його функцію і стімуліруеттем самим ексцизійної репарацію ДНК. Зв`язування р53 з белкомRad51 веде до стимуляції рекомбінації ДНК і підвищенню еффектівностірепарацію двунітевих розривів ДНК. На участь р53 в репарацііДНК вказує також і його здатність проявляти активність 3`-5`-екзонуклеазиі дізнаватися ділянки одноцепочечной ДНК і / або неспарені підстави.

Мал. 3. Схематичне зображення різних конформаційних состоянійр53, які розпізнаються специфічними антитілами. Онкогенні мутаціівизивают незворотний перехід молекули в денатуровані стан, при якому відкривається раніше недоступний епітоп і, навпаки, зникають деякі раніше доступні епітопи.

Характерні для пухлинних клітин міссенс-мутації призводять крезкому зміни конформації молекули білка р53 (Рис. 3), щов значній мірі зачіпає всі з вищевказаних його активностей: відбувається втрата або ослаблення здатності зв`язувати і актівіроватьгени з р53-респонсівнимі елементами, репресувати інші спеціфіческіегени-мішені, пригнічувати реплікацію ДНК і стимулювати репараціюДНК. Причому, так як р53 утворює тетрамерние комплекси, мутації одному алелів гена р53 викликають інактивацію і продукту другого, неушкодженого алелі. Справа в тому, що коекспрессірующіеся нормальнийі мутантний білок р53 утворюють неактивні гетеромерного комплекси.Такім чином, мутантний білок пригнічує функції нормальногобелка р53 по домінантно-негативного механізму. Мабуть, іменноета особливість мутантних р53 в значній мірі ответственназа їх онкогенний потенціал. На користь цього свідчить тотфакт, що введення в клітини короткого поліпептиду, соответствующегоолігомерізаціонному домену р53, порушує утворення полноценнихтетрамерних комплексів р53 і викликає пухлинну трансформацію.Необходімо помітити, що крім втрати нормальних функцій р53, мутантні р53 з амінокислотними замінами в гарячих точках (кодони175, 248 і ін.) набувають нових властивостей, не властиві белкур53 дикого типу (gain-of-function). Так, описано пріобретеніемутантнимі р53 здатності активувати промотори протоонкогеновMYC і ERB1, антиапоптотического гена BGL1 з сімейства Bcl2, генаMDR1, детерминирующего множинну лікарську устойчівостьклеток і т.д. Передбачається, що це обумовлено способностьюнекоторих мутантних р53 пов`язувати білки, зокрема інші факторитранскріпціі, з якими нормальна р53 не взаємодіє, імодіфіціровать експресію генів, регульованих цими транскріпціонниміфакторамі.

3.3.3. Фізіологічні функції р53 і їх порушення в неопластіческіхклетках

Молекули білка р53 можуть перебувати в різних конформаціоннихсостояніях, в яких вони мають різні біохімічними актівностяміі виконують різні фізіологічні функції. У звичайних условіяхр53 знаходиться в так званій латентній формі, в якій він обладаетслабой транскрипционной активністю. Такий р53, однак, связиваетбелкі репарационной машини (див. Вище), проявляє активність 3`-5`-екзонуклеазиі стимулює рекомбінацію і репарацію ДНК. При різних стрессахі внутрішньоклітинних пошкодженнях відбуваються пост-трансляціонниемодіфікаціі, зокрема фосфорилирование і ацетилювання определеннихамінокіслот молекули р53, що визначають її перехід в так називаемуюстрессовую конформацию. Такий р53 значно більш стабільний (т.е.резко збільшується його кількість в клітці) і ефективно транс-Активуєте / або транс-репресує специфічні гени-мішені, следствіемчего є індукція в аномальних клітинах або припинення клеточногоцікла, або апоптозу. Крім того, активація р53 веде до ізмененіюекспрессіі генів деяких секретується факторів, в результатічого може змінюватися розмноження і міграція не тільки пошкодженої, а й оточуючих клітин. При цьому, перебуваючи в стресовій конформації, р53 в значній мірі втрачає активності, стімулірующіерекомбінацію і / або репарацію ДНК.

р53 дикого типу, на додаток до латентної і стресовій, можетвременно купувати і так звану мутантних конформацию, сходнуюс тієї, в яку молекула р53 необоротно переходить при онкогеннихмутаціях. Транзиторний перехід р53 в мутантних конформацию проісходітпрі впливі певних цитокінів та / або Морфогенія (PDGF, тромбопоетин, ретиноевая кислота і ін.). Біологічний сенс такогоперехода поки неясний. Можливо, він полягає в повній інактіваціірост-інгібуючих активностей р53 і / або зміні набору його генів-мішеней.

Таким чином, р53 відіграє важливу охоронну роль, будучи по образномувираженію D.Lane, "стражем генома". Його повседневнаяфункція полягає, мабуть, в розпізнаванні і ісправленііошібок, незмінно виникають в ході реплікації ДНК. При массівнихповрежденіях ДНК, інших внутрішньоклітинних порушеннях або угрозеіх виникнення відбувається перемикання функцій р53 (Рис. 4): купуючи транскрипційні активності і змінюючи експресію генів-мішеней, він викликає або зупинку розмноження аномальних клітин (тимчасову, для усунення пошкоджень, або необоротну), або їх загибель (фактори, що визначають долю клітини при активації р53 будуть рассмотрениніже). В результаті усувається можливість накопичення в організмегенетіческі змінених клітин.

Механізми активації р53 при стресах і внутрішньоклітинних поврежденіях.Актівація транскрипційних функцій р53 спостерігається при самих разнообразнихстрессах і внутрішньоклітинних порушеннях: УФ- і g-опроміненні, присутні клітини розірваної ДНК, зниженні внутрішньоклітинного пулу нуклеотидів, ингибировании ДНК і РНК-полімерази, гіперекспрессіі онкогенов, вірусної інфекції, гіпоксії, оксидативному стресі, гіпо- та гіпертермії, різних порушеннях клітинної архітектури (збільшення числа ядер, зміни цитоскелету і адгезії) і т.д.

Ключову роль в стабілізації білка р53 і підвищенні його транскріпціоннойактівності грають зміни взаємодії р53 з білком-інгібіторомMdm2, ген якого є потенційним онкогеном. Білок Mdm2связивается з N-кінцем молекули р53 і, володіючи активностями Е3убіквітін-лігази, стимулює убіквітінізацію і, як результат, протеосомную деградацію білка р53. Тому, в нормі рівень експрессіір53 дуже невеликий, а час його життя становить всього близько 30 хвилин. Крім того, зв`язуючись з N-кінцевим ділянкою р53 в районедомена, що взаємодіє з базовими факторами транскрипції, Mdm2 пригнічує здатність р53 транс-активувати гени-мішені.

A)

Б)

Мал. 4. Охоронні функції р53.
А). функції "латентної" і "стресовій" формр53.
Б) Фактори, що викликають транскрипційних активацію р53, гени-мішеніактівірованного р53 і викликані змінами їх експресії біологіческіееффекти.

При внутрішньоклітинних порушеннях, зокрема при поврежденіяхДНК, відбувається фосфорилювання р53 по сайтам (Ser15, Ser20, Ser33), розташованим в районі зв`язування з білком Mdm2. Такоефосфорілірованіе здійснюють специфічні кінази (ATM, ATR, і їх мішені - чекпойнткінази CHK1, CHK2), які актівіруютсяв відповідь на різноманітні порушення структури ДНК (див. Розділ 3.11.1) .Крім того, ATM фосфорилирует і білок Mdm2. В результаті блокіруетсясвязиваніе р53 з Mdm2, що викликає стабілізацію молекул р53 іповишеніе їх транскрипционной активності. При деяких другіхвнутріклеточних зміни, наприклад при експрес в клітці актівірованнихонкогенов RAS, також спостерігається порушення взаємодії р53і Mdm2, але відбувається воно з-за підвищення експресії білка pARF, продукту альтернативної рамки зчитування гена INK4a (див. Раздел3.4). Білок pARF має здатність зв`язуватися або з N-концевимучастком р53, або з білком Mdm2, перешкоджаючи, таким чином, їх безпосередньої взаємодії один з одним. Цікаво, що ген MDM2 сам є транскрипционной мішенню актівірованногор53. В результаті встановлюються регуляторна петля, стімулірующаядеградацію білка р53 після закінчення дії факторів, визивающіхего фосфорилирование або зв`язування з білком pARF.

Важливу роль в придбанні молекулами р53 конформації, способнойтранс-активувати гени-мішені, грають також модифікації С-концевогоучастка, а саме ацетилювання його певних амінокіслотнихостатков. При пошкодженнях ДНК і експресії активованого онкогенаRAS ці події ініціюються зв`язуванням звільняється від Mdm2N-кінцевої ділянки p53 з базальним фактором транскрипції Р300 / CBP, ацетилюється спочатку інгібіторний домен р53 по лізину 373 і382, а потім (після зв`язування р53 з респонсівнимі елементами) і білки хроматину в області генів-мішеней. Таким чином, последовательниепост-трансляційні модифікації N-кінцевого і С-кінцевого участковр53 викликають збільшення кількості білка р53 в клітці, пріобретеніеім здатності зв`язувати р53-респонсівние елементи і рекрутіроватьк генам мішенях базові фактори транскрипції (компоненти комплексаTFIID РНК-полімерази II і гістонові ацетілази p300 / CBP , деконденсірующіехроматін), стимулюючи тим самим транскрипцію їх мРНК.

При деяких стресах, зокрема при гіпоксії, наблюдаютсяпост-трансляційні зміни р53, що викликають його перехід не кклассіческой стресовій конформації, а до її варіанту. Такий р53не транс-активує гени, що містять р53-респонсівние елементи, але пригнічує транскрипцію інших генів-мішеней. Ця, так називаемаярепрессіонная, форма також фосфорильованій по N-кінця, але її С-концевойучасток НЕ ацетильованого і пов`язує репрессіонним комплекси Sin3 / HDAC, що викликають конденсацію хроматину генів-мішеней.

Гени-мішені р53 і їх функції. В даний час, крім Mdm2, що забезпечує регуляцію самого р53 за принципом зворотного зв`язку (див. Вище), ідентифіковано більше сотні генів, які є мішенямітранскріпціонних активностей р53. Вони можуть бути розділені нанесколько груп, виходячи з їх фізіологічних функцій (Рис. 4Б).

Першу групу складають гени, продукти яких регулюють клеточнийцікл. Найважливішим із них є білок p21Waf1 / Cip1 - інгібіторціклінзавісімих киназ з сімейства Cip / Kip. Підвищення його експрессіівизивает зупинку клітинного циклу в пізній фазі G1, що обусловліваетсясвязиваніем їм комплексів циклін Е / Сdk2, придушенням їх способностіфосфоріліровать білки сімейства рRB і звільняти транскріпціонниефактори E2F (див. Розділ 3.2.2). Дублюючим механізмом остановкіперехода з G1 в S є придушення активованим р53 транскріпціігена DP1 - транскрипційного фактора, який зв`язується з E2Fі утворює активний комплекс, власне і активує сінтезпродуктов, необхідних для входу в фазу S. Заслуговує також вніманіяспособность р53 підвищувати експресію гена Siah1, продукт которогостімулірует деградацію b -катеніна - транскрипційного фактора, що активує транскрипцію гена цикліну D і онкогена MYC (див.розділ 3.4.2), що вносить додатковий внесок в індукцію остановкіклеточного циклу в G1. Слід зауважити, що р53 може подавлятьактівность Cdk2 не тільки в результаті зміни своїх транскріпціоннихфункцій, але і за рахунок білок-білкових взаємодій, а іменнонепосредственного зв`язування цикліну Н - компонента кіназногокомплекса CAK, що здійснює активирующее фосфорилирование ціклінзавісімихкіназ.

Ідентифіковано також ряд генів-мішеней р53, продукти которихвизивают зупинку в фазі G2 (затримка в ній спостерігається в разі, коли р53 активували вже після того як клітина пройшла G1-Чекпойнт, або в клітинах з інактивованих G1-Чекпойнт). Актівірованнийр53 пригнічує функцію комплексу циклін B / Cdc2, що грає ключевуюроль в переході з G2 в мітоз, по кількох механізмів. По-перше, він транс-активує ген 14-3-3-s, білковий продукт якого связиваеті секвеструє комплекси циклин B / Cdc2 в цитоплазмі, які не даваявозможності їм потрапити в ядро, де вони і повинні проявляти своюактівность. По-друге, він транс-активує ген GADD45, белковийпродукт якого має здатність зв`язувати Сdc2, разрушаятакім чином комплекси циклин B / Cdc2. По-третє, р53 репрессіруеттранскріпцію генів цикліну B і Cdc2, що зменшує синтез їх продуктов.Следует помітити, що, як і в разі зупинки клітинного циклани G1, затримка в G2 при пошкодженнях ДНК спостерігається і в клеткахс інактивованих р53: вона відбувається в результаті подавленіяфункціі фосфатаз Cdc25 (Cdc25A при зупинці в G1 і Cdc25C припинення в G2), що активують відповідні цікдінзавісімиекінази. Однак в клітинах з порушеною функцією р53 проісходітлішь короткочасна затримка в Чекпойнт, а активація р53 обеспечіваетдлітельную зупинку клітинного циклу, що запобігає размноженіевплоть до виправлення дефекту.

Наступна група р53-регульованих генів кодує білки, індуцірующіеапоптоз. При цьому р53 контролює синтез компонентів обох основнихпутей індукції апоптозу: і мітохондріального, і стимулюється"рецепторами смерті". Так, він регулює актівностьбелков сімейства Bcl2, репресуючи ген анти-апоптотического белкаBcl2 і активуючи гени про-апоптотичних білків Bax, Puma і Noxa.Повишеніе проникності мітохондріальної мембрани для цітохромаС і білка AIF досягається і транс-активацією гена p53AIP1 (егопродукт локалізується в мітохондріальної мембрани і зменшує мембраннийпотенціал) і гена PIG3 (кодує оксіредуктази, яка вовлеченав освіту радикалів кисню, що ушкоджують мембрани мітохондрійі стимулюючих викид їх вмісту). Стимуляція апоптозу, запускаемогорецепторамі смерті досягається транс-активацією генів двох ізтакіх рецепторів - Fas і Killer / DR5 (рецептор для TRAIL). Ещеодной такий мішенню є ген недавно ідентифікованого белкаPidd, який містить домен смерті і при гіперекспрессіі індуціруетапоптоз. Виявлено й інші р53-респонсівние гени (IGF-BP3, PAG608, p85, циклин G), продукти яких стимулює апоптоз, проте механізмиіх апоптогенних дії поки вивчені досить погано. Крімтого, р53 може індукувати апоптоз і через інші механізми, незв`язані з його здатністю змінювати експресію генів-мішеней.Так, мутантні р53, що втратили транскрипционному активність (врезультаті делеции С-кінцевої ділянки або мутацій в кодонах 22-23), зберігають проте здатність індукувати апоптоз в деяких (але не у всіх) типах клітин. Передбачається, що цей еффектобусловлен білок-білковими взаємодіями р53. Таким чином, при підвищенні функціональної активності р53 може проісходітьактівація відразу багатьох шляхів індукції апоптозу, що, мабуть, забезпечує надійність його реалізації.

Так як р53 контролює активність генів, продукти яких способнивизвать як зупинку клітинного циклу в різних його фазах, так і апоптоз, виникає питання, чому залежить вибір долі клеткіпрі активації р53. З`ясувалося, що він визначається множествомфакторов: гістогенетичної типом клітин (наприклад, в нормальнихфібробластах, як правило, спостерігається зупинка клітинного циклу, тоді як в лімфоцитах - апоптоз), ступенем активації р53 (з увеліченіемуровня його експресії підвищується ймовірність апоптозу), функціональнойактівностью сигнального шляху pRb- E2F (в фібробластах c інактівірованнимpRb або гіперекспрессірованним E2F, спостерігається не зупинка вG1, а апоптоз) і т.д. Нещодавно виявлено, що ще одним фактором, що визначає вибір між зупинкою клітинного циклу і апоптозом, є характер модифікації самих молекул р53 і / або їх білок-белковихвзаімодействій. Так р53, фосфорілірованний по Ser15 / 20 і ацетілірованнийпо С-кінця, здатний транс-активувати ген p21Waf1 / Cip1 і визиватьостановку в G1, тоді як додаткове фосфорилювання по Ser46прідает йому здатність транс-активувати поряд з геном p21Waf1 / Cip1і ген білка р53AIP1, а в цьому випадку вже спостерігається апоптоз.Прічем ймовірність фосфорилювання Ser46 підвищується з увеліченіемінтенсівності пошкоджень ДНК. Крім того, здатність р53 ізбірательнотранс-активувати проапоптотическими гени (BAX і ін.) Увелічіваетсяпрі його зв`язуванні з білками сімейства ASPP (ASPP1 і ASPP2), потеряекспрессіі яких характерна для значної частини випадків ракамолочной залози.

Третьою великою групою генів-мішеней р53 є гени, продуктикоторих регулюють морфологію і / або міграцію клітин (Рис. 4Б) .Так, р53 транс-активує гени обох представників семействарассеівающіх (Scatter) чинників - HGF / SF і HGF1 / MSP, а також генодного з членів сімейства епідермальних чинників зростання HB-EGF (гепарин-зв`язуючий EGF) (продукти всіх цих генів є одновременноі митогенами, і мотогенамі). При цьому, р53 транс-активує такжегени рецепторів цих факторів - HGF / SF-R (Met) і EGF-R. р53-респонсівнимітакже є гени Хемокіни фракталкіна, гладеньком`язового a-актину, колагену II1 і Vl1 типів, інгібітору плазміногену PAI-1. З іншогобоку р53 репресує гени фибронектина і металлопротеіназиI типу. Фізіологічне значення такого регулювання поки не установлено.Возможно, воно полягає, принаймні частково, в прівлеченіік клітинам з активованим р53 оточуючих клітин определеннихтіпов для ремоделювання / відновлення структури тканини в местевозможного апоптозу. Не виключено участь такої регуляції і впроцессе морфогенезу.

В особливу групу генів-мішеней р53 можна виділити гени, контролірующіеангіогенез. Ключову роль в неоангіогенез грає VEGF (VascularEndothelial Growth Factor- стимулює розмноження і міграціюендотеліцітов), експресія якого повищается при гіпоксії іліактіваціі деяких онкогенів. р53 репресує транскрипцію какгена VEGF, так і гена HIF-1 (Hypoxia Inducing Factor 1) - транскріпціонногофактора, що забезпечує підвищення експресії VEGF і його рецепторовв відповідь на зменшення вмісту кисню (крім цього HIF-1ізменяет експресію генів, що контролюють транспорт глюкози ігліколіз, що забезпечує адаптацію клітин до умов гіпоксії) Одночасно р53 може транс-активувати гени білків, інгібірующіхангіогенез - тромбоспондину (Tsp) -1, -2 (пов`язуючи спеціфіческіерецептори на поверхні ендотеліоцитів, вони викликають в них апоптоз) і BAI-1. Таким чином клітини з активованим р53 гірше переносятнедостаток кисню, перестають секретировать VEGF і начінаютсекретіровать інгібітори ангіогенезу, що перешкоджає образованіюнових судин. Дані функції є, мабуть, ще однойсоставляющей пухлина-супрессірующего дії р53, так як оніпредотвращает адаптацію до гіпоксії і проростання судин в центропухолі.

Виявлено ще кілька десятків генів-мішеней р53. Серед ніхследует відзначити ген каталітичної субодиниці теломерази (TERT), який репресує р53 (таким чином, р53 бере участь, мабуть, і в забезпеченні репликативного старіння клітин. Мабуть, р53прінімает участь і в процесах дозрівання клітин, так як деякіз транс-активуються їм генів кодують білки репертуару тієї ілііной диференціювання (м`язова креатинкиназа і ін.).

Наслідки порушень функції р53. Характерні для опухолевихклеток аномалії р53 скасовують або послаблюють всі найважливіші функцііопухолевого супрессора р53. Делеция обох алелей гена р53, тобто повна інактивація, викликає ослаблення G1- і G2-чекпойнтовклеточного циклу, придушення індукції апоптозу, зменшення еффектівностірепараціі ДНК, більш ефективну адаптацію до гіпоксії і стімуляціюнеоангіогенеза, ослаблення контролю за довжиною теломер, інгібірованіедіфференціровкі і інші характерні властивості неопластіческойклеткі. Особливо слід відзначити виникнення в клітинах з інактівірованнимр53 сильної генетичної нестабільності, що є мотором дальнейшейопухолевой прогресії. Втрата функціональної активності р53 значітельноувелічівает темп появи розмножуються клітин з самими разнимігенетіческімі аномаліями - зміненим числом і перебудовами хромосом, генними мутаціями, амплификацией окремих ділянок геному.

Подібні наслідки спостерігаються і при найчастіших в новообразованіяхчеловека аномаліях р53 - міссенс-мутаціях, що ведуть до синтезу неактівногобелка, що володіє домінантно-негативним ефектом в отношенііпродукта неушкодженого алелі. Слід зауважити, однак, чтостепень прояви домінантно негативного ефекту мутантного р53варьірует в залежності від конкретної амінокислотною заміни, тіпаклеток і інгібіруемой функції р53 дикого типу. Тому нередкоселектівное перевагу отримують клони клітин, в яких в результатедополнітельних генетичних подій відбувається делеція або мутаціяі другого алеля гена р53. У той же час, пухлинні клітини, какправіло, зберігають експресію хоча б одного мутантного аллелягена р53. Очевидно, це пов`язано з тим, що з`являються в результатеміссенс-мутацій нові активності мутантних р53 вносять дополнітельнийвклад в підвищення онкогенного потенціалу клітини. Так, пріобретаяспособность транс-активувати онкоген MYC, мутантний р53 викликає, очевидно, більш сильні порушення регуляції клітинного циклу, ніж ті, які спостерігаються при делециях гена р53. Нові актівностімутантних білків р53 відповідальні також за додаткове ослабленіеіндукціі апоптозу і розвиток стійкості до дії хіміопрепаратов.В основі придушення апоптозу лежить кілька механізмів: транс-актіваціямутантним р53 гена антиапоптотического білка Bag1 (член семействаBcl2), здатність мутантних р53 пов`язувати і инактивировать гомологр53, білок Р-73 (див . наступний розділ) і т.д. Виникнення устойчівостік певним протипухлинною цитостатикам може бути связанотакже зі здатністю деяких мутантних р53 підвищувати транскріпціюгена MDR1 (Multi-Drug Resistance 1 - див. Розділ XII.2.1.1) і генадУТФ-ази, продукт якого блокує дію 5-фторурацилу іряд інших антиметаболітів. Слід зауважити, що характерниедля пухлин людини мутації диференційно впливають на вознікновеніевишеуказанних активностей. Так, заміни в кодонах 175 і 248 прідаютспособность активувати ген дУТФ-ази, тоді як мутації в кодоне273 не викликають придбання такого властивості. Тому, іспользованіемутацій р53 в якості критерію для передбачення чувствітельностік тієї чи іншої хіміотерапії може бути засноване лише на точнойідентіфікаціі амінокислотних замін, а не на гистохимической детекції"нормального" або "мутантного" р53 з помощьюконформаціонно-специфічних антитіл.

Таким чином, мутації та інші зміни активності р53 визиваютодновременное поява цілого набору характерних властивостей неопластіческойклеткі, таких як зниження чутливості до різних зростання-супрессірующімсігналам (в тому числі генеруються перманентної експресією актівірованнихонкогенов), імморталізаціі, підвищення здатності виживати в неблагопріятнихусловіях, генетична нестабільність, стимуляція неоангіогенезу, блокування клітинного диференціювання і т.д. Це, очевидно, іявляется поясненням такої частої зустрічальності мутацій р53 в самий різних новоутвореннях - вони дозволяють за один крок преодолетьсразу кілька етапів пухлинної прогресії. Причому, мутаціір53 можуть бути як ініціальним подією (синдром Лі-Фраумені) або детермінувати початкові етапи канцерогенезу, так і вознікатьі відбиратися вже в ході росту пухлини, забезпечуючи пріобретеніенових агресивних властивостей і стійкості до терапії.

3.3.4. Гомологи р53: Р63 і Р-73

Нещодавно були виявлені два гени, Р63 і Р-73, продукти которихімеют досить високу ступінь гомології з білком р53 в участкахтранс-активаційного, ДНК-зв`язуючого і олігомерізаціонного доменів, але значно відрізняються від нього по C-кінця. Однак, на відмінувід гена р53, що кодує по суті один білковий продукт, що піддається, правда, самим різним пост-трансляційним модифікаціям, гени р63і Р-73 продукують по кілька білків. Справа в тому, що мРНК каждогоіз них може синтезуватися з двох промоторів і далі подвергатьсяальтернатівному сплайсингу. В результаті утворюється по 6 ізоформбелков Р63 і Р-73, що володіють (ТА-форми) або не володіють (? DN-форми) транс-активаційним доменом. Причому форми, що містять транс-актіваціоннийдомен здатні активувати р53-респонсівние гени і викликати, зокрема, апоптоз. Крім того, ТА-форми Р63 і Р-73 можуть транс-актівіроватьі ряд інших генів, що містять близькі за структурою респонсівниеелементи, які не є, проте, мішенями р53. Зокрема, вони транс-активують гени білків Jag1 і Jag2 - лігандів для рецепторовNotch, активація яких грає ключову роль у виборі судьбиклеткі при виборі напрямку її диференціювання.

Існує ще ряд відмінностей між р53 і його гомологами. Так, еслір53 експресується в клітинах практично всіх тканин, то егогомологі експресуються тільки в деяких типах клітин. Наприклад, Р63 переважно експресується в ембріональних клітинах, атакож стовбурових і недиференційованих епітеліальних клітинах взрослогоорганізма, причому у вигляді транскрипційно-неактивних? DN-форм.Предполагается, що експресія? DN-форм Р63 забезпечує недіфференцірованноесостояніе клітини. При нокауті гена Р63 у мишей спостерігається пренатальнаяілі постнатальная загибель ембріонів внаслідок повного отсутствіякожі і інших епітелільних тканин (передбачається, що це связанос передчасної дифференцировкой стовбурових клітин епітелію іісчерпаніем їх запасу до моменту народження тварин). Далі, еслір53 активується у відповідь на найрізноманітніші стреси, то його гомологітолько на деякі з них, причому за рахунок абсолютно інших механізмов.Наконец, якщо р53 виконує функції пухлинного супрессора і дляновообразованій характерна його інактивація, то його гомологи немають таких функцій. Про це свідчить дві групи фактов.Во-перше, у мишей гомозиготний нокаут гена Р-73 не викликає повишеніячастоти виникнення пухлин (нокаут гена Р63 несумісний сжізнью ембріонів - див. Вище). По-друге, в пухлинах людини не виявлявся втрата експресії або мутації генів Р63 і Р-73. Навпаки, в них нерідко відзначається підвищення експресії цих білків, причому, як правило, транскрипційно-неактивних? DN-форм (тобто Р63 і р73являются швидше протоонкогенів). У зв`язку з цим набуває популярностьгіпотеза, згідно з якою? DN-форми білків Р63 і Р-73 функціоніруюткак природні інгібітори р53, що пригнічують його функцію по домінантно-негатівномумеханізму. Дійсно, їх транскрипційно-неактивні тетрамеримогут конкурувати з р53 за місця посадки на ДНК генів-мішеней, а мономери / димери - секвеструвати р53 шляхом зв`язування його молекули освіти неактивних комплексів. Це не виключає, однак, що при порушеннях функції р53 відбувається активація транскріпціоннойфункціі його гомологів (показано, що р53 репресує транскріпціюгена Р-73), яка може частково компенсувати втрату функціір53 і забезпечувати, наприклад, нормальний розвиток мишей з гомозіготнимнокаутом гена р53. Ці припущення, як і інші аспекти біологіческіхфункцій гомологів р53, вимагають подальшого дослідження.