Онкологія-

Б.П.Копнін

Російський онкологічний науковий центр ім. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

джерело RosOncoWeb.Ru

01 0203 04
4. Онкогени, пухлинні супресори і порушення морфогенетіческіхреакцій клітини

Яскравим відмітною властивістю неопластичних клітин є"асоціальний" тип їхньої поведінки, пов`язаний в першу очередьс порушеннями нормальних морфогенетических реакцій - втратою контактноготорможенія розмноження, придбанням здатності до проліфераціінезавісімо від прикріплення до субстрату, змінами адгезіоннихвзаімодействій, форми і рухливості клітин і т.д. Саме ці нарушеніявместе з деякими іншими властивостями, зокрема способностьюсекретіровать протеолітичні ензими і ангіогенние чинники, предопределяютінвазівний характер росту (проникнення в навколишні здоровиеткані), а згодом і метастазування (освіта вторічнихочагов пухлинного росту) [118]. Першорядну роль в вознікновенііуказанних вище порушень морфогенетических реакцій відіграють ізмененіяфункціі протоонкогенов і / або пухлинних супресорів (рис.7, 8).

Мал. 7. Зміни активності супресорних білків і контроліруемихпротоонкогенамі сигнальних шляхів, що визначають залежність клетокот прикріплення до субстрату і контактне гальмування розмноження (пояснення в тексті)

Мал. 8. Регульовані онкогенами сигнальні шляхи, ответственниеза зміни морфології і локомоторним фенотип неопластіческіхклеток (пояснення в тексті)

Притаманне нормальним клітинам контактне гальмування розмноження (припинення проліферації при встановленні контактів з окружающіміклеткамі) пов`язують в першу чергу з підвищенням експресії опухолевихсупрессоров p16INK4a і p27KIP1 [37,119,120], що обусловліваетнедофосфорілірованіе pRb і блокування входу в S-фазу [17] (див.розділ 1). Шляхи передачі сигналу від плазматичноїмембрани кінгібіторам циклінзалежної киназ поки неясні. Показано тільки, що підвищення в епітеліальних клітинах експресії Е-кадхерина, викликане трансдукцией його гена, веде до накопичення p27KIP1 іостановке клітинного росту [121]. Нещодавно з`явилися дані про існування епітеліальних клітинах ще одного шляху блокування клеточногоцікла у відповідь на встановлення міжклітинних контактів. Продемонстровано, що освіта епітеліального пласта викликає накопичення р53, тоді як мутації Е-кадхерина і / або роз`єднання міжклітинних контактів, навпаки, викликають дестабізацію р53 і, як наслідок, прекращеніеінгібірующего впливу p21WAF1 на комплекси циклин - Cdk. У зв`язку з цим можна думати, що онкогенний потенціал мутацій Е-кадхерина, відповідальних за розвиток спадкових форм раку шлунка і багатьохінших новоутворень [122], принаймні частково обусловленізмененіямі регуляції клітинного циклу, апоптозу і контролю генетіческойстабільності [123].

Поряд з інактивацією ряду пухлинних супресорів (Е-кадхерін, р53, p27KIP1, pRb), викликаної мутаціями або зв`язуванням з вірусниміонкобелкамі (pRb - c E1A, E7, T-SV40- p53 - c E1B, E6, T-SV40-p27KIP1 - c E1A і т.д. [7,10,124]), до втрати контактного торможеніяразмноженія може призводити і гіперфункція протоонкогенов, модіфіцірующіхактівность сигнального шляху Cdk-pRb-E2F. Зокрема, вона можетбить викликана підвищенням експресії Myc або активацією протоонкогенаRas (перший викликає деградацію p27KIP1 і трансактіваціі Cdc25a, другий - деградацію p27KIP1 і підвищення експресії циклін D1, див. 1).

Незалежність від прикріплення до позаклітинного матриксу (anchorageindependence). Щоб виживати і пролиферировать, нормальні клеткібольшінства типів повинні бути прикріплені до позаклітинного матріксу.Два основні чинники лежать в основі цього явища: неспособностьростових факторів активувати в ненатягнутих клітинах комплексиціклін E - Cdk2, відповідальні за вхід в S-фазу [125], і індукціяапоптоза в багатьох типах клітин при відсутності адгезійних взаємодій (цей тип апоптозу має спеціальну назву "аноікіс") [126]. І придушення проліферації, і індукція апоптозу в непрікрепленнихклетках можуть бути пов`язані з активацією р53, спричиненої открепленіемклеток від субстрату і відсутністю сигналів від рецепторів інтегринів [58,127]. За придушення входу в S-фазу крім активації сігнальногопуті р53-p21WAF1, по всій видимості, відповідальна і аккумуляціяp27KIP1, також закономірно спостерігається при відсутності контактовклеток з матриксом [127,128]. Однак крім запуску механізмовнегатівного контролю проліферації (блокування входу в S-фазу індукція апоптозу) у відповідь на відкріплення клітин від матріксасуществуют і незалежні механізми позитивної регуляції виживання розмноження клітин, що ініціюються зв`язуванням интегринов з белкамівнеклеточного матриксу та наступною активацією нерецепторнойтірозінкінази FAK (Focal Adhesion Kinase - ключового участнікапередачі сигналів від інтегрінових рецепторів, фізично взаімодействующегос цитоплазматическим доменом b-субодиниці интегрина [118,126]). По-перше, зв`язування інтегринів з матриксом і активація FAK необходімидля проходження мітогенного сигналу від рецепторів ростових факторів (EGF, PDGF) до кінцевих МАР кіназ - ERK1 / 2 . (В непрікрепленнойклетке сигнали від цих ростових факторів блокуються на промежуточнойМАР кінази MEK1, яка в силу якихось невідомих поки причин фосфорилирует свої мішені - ERK1 / 2 [64].) По-друге, актівіруяRas через адаптерний білок Shc, інтегріновие рецептори НЕ толькостімуліруют мітогенний сигнал, але і пригнічують аноікіс (апоптоз), по всій видимості, за рахунок активації сигнального шляху Ras-PI3K-PKB / Akt [126] (див. розділ 2).

Якщо виходити з факту існування кількох механізмів, определяющіхзавісімость життєздатності та / або розмноження клітин від їх связиваніяс матриксом, стає зрозумілим, що для виникнення характернойдля пухлинних клітин незалежності від адгезійних взаімодействійнеобходімо, мабуть, кілька подій, які, з одного боку, дозволяли б долати супресорні ефекти р53 (мутації / делецііетого гена, гіперекспресія онкогена MDM2 і ін.) і / або p27KIP1 (мутації / делеціі- гіперекспресія онкогенов RAS і MYC, пріводящаяк деградації даного білка, та ін.), а з іншого, - обходити прериваніемітогенного сигналу на рівні МЕК1 кінази (наприклад, за рахунок актіваціібелков Src або Myc, що викликають активацію комплексів циклін E -Cdk2) і блокувати аноікіс по сигнальному шляху Ras-PI3K-PKB / Akt.

Зміни форми і рухливості клітин. Зміна форми (морфології) - характерна властивість пухлинних клітин, що дозволяє при мікроскопіческомісследованіі диагносцировать злоякісну трансформацію. Воснове морфологічних порушень лежать пов`язані між собою ізмененіяцітоскелета, адгезійних взаємодій клітин один з одним ис позаклітинним матриксом. Коротенько вони виражаються в порушенні формірованіяфокальних контактів і в погіршенні прикріплення клітин до матриксу, дезорганізації системи актінових микрофиламентов. Це приводитк змін активності псевдоподий і характеру переміщення клеток.В цілому спостерігається картина нагадує зміни, вознікающіі нормальних клітинах при дії мотогенних цитокінів - факторів, що стимулюють пересування клітин. Однак так званий локомоторнийфенотіп в неопластических клітинах, як правило, сильно перебільшений, що дозволяє відрізняти по морфології пухлинну клітину від двіжущейсянормальной клітини.

Молекулярні механізми, що визначають виникнення локомоторногофенотіпа, як в нормальних клітинах при мотогенних стимулах, таки при неопластической трансформації, поки далекі від ясності. Виявленилішь деякі ключові вузли в пересічних ланцюгах передачі сигналів, відповідальних за виникнення цих змін. Як відомо, многіецітокіни (наприклад, HGF / SF, EGF, FGF, PDGF, IGF-1 та ін.) Являютсяодновременно і митогенами, і мотогенамі [118]. Так, HGF / SF (HepatocyteGrowth Factor / Scatter Factor) є сильним мітогеном для гепатоцитів, але мотогеном для різних епітеліальних клітин, зокрема клетокмолочной залози, ендотеліоцитів і ін. Мотогенний ефект HGF / SFзавісіт від викликається ним стимуляції Ras-Raf-MAPК сигнальних шляхів : про це свідчить його скасування при пригнічення функції МЕК1і блокуванні передачі сигналу до ERK1 / 2 [129-131]. У той же времяодного тільки підвищення активності Raf, мабуть, недостаточнодля розборки в епітеліальних клітинах Е-кадхерінових межклеточнихконтактов і стимуляції локомоции клітин - необхідна одновременнаяактівація і PI3K, яка при дії HGF / SF може індуціроватьсякак по Ras-залежного, так і по Ras- незалежним сигнальним шляхам [130,132]. Ефектори PI3K, відповідальні за реалізацію мотогенногоеффекта, невідомі. Показано тільки, що ні PKB / Akt, ні Rac саміпо собі його не забезпечують [130], хоча базальний рівень актівностіRac, мабуть, необхідний для здійснення перебудов цітоскелетаі роз`єднання міжклітинних контактів, потрібних для локомоції [132]. Показано також, що одним з важливих ефектів, визиваемихHGF / SF в клітинах лейоміосаркоми, є зниження експрессіігена фибронектина, що може змінювати адгезійні взаімодействіяс матриксом і локомоцию [133]. Мутації гена рецептора HGF / SF (протоонкогенаMet), що призводять до перманентної стимуляції його тірозінкіназнойактівності, є онкогенними: вони здатні викликати морфологіческуютрансформацію в культивованих in vitro клітинах [134] і ответственниза розвиток спадкового папілярного раку нирки, а також деякихінших захворювань людини (табл. 1) . Молекулярні основи мотогеннихеффектов іншихцитокінів вивчені ще гірше, але передбачається, що, як і в випадку з HGF / SF, вони пов`язані зі стимуляцією Ras-PI3Kі Ras-MAPК сигнальних шляхів [135-139].

Конститутивна експресія активованих онкогенів Ras визиваеті в фібробластах, і в епітеліальних клітинах різке підвищення локомоторнойактівності і стійкі морфологічні зміни, характерні длянеопластіческіх клітин [140,141] (зауважимо, однак, що ці ізмененіяхорошо проявляються лише в клітинах з аномаліями р53- і / або p16INK4a-регуліруемихсігнальних шляхів - в інших випадках у відповідь на перманентнуюгіперекспрессію Ras може індукувати або апоптоз, або остановкав G1, що зменшує ступінь вираженості Ras-індукованих морфологіческіхізмененій [117,142]. Передбачається, що кілька еффекторовRas, в першу чергу Raf і GTPази сімейства Rho (Rac, Cdc42, Rho) , відповідальні за прояв морфологічної трансформації за стимуляцію локомоторною активності неопластичних клітин [20,143] (рис. 8). Як і при мотогенних ефекти цитокінів, ключевуюроль тут, мабуть, грає активація двох сигнальних каскадів: Ras-PI3K-Rac і Ras-Raf -ERK [20,143-145]. Для трансформації фібробластів, очевидно, досить конститувною активації будь-якого з цих путей.Действітельно, трансдукція активованого Rac1, як і актівірованнихRaf, Mos (подібно Raf стимулює MEK1), або самої МЕК1 можетвизивать морфологічну трансформацію фібробластів гризунів [146 -150], а блокування в Ras-трансформованих клітинах функції або MEK1, або Rac, хоча і призводить до часткової реверсії морфологіческіхізмененій, але не запобігає трансформацію [148,151]. У той ж час в епітеліальних клітинах, добре трансформуються онкогеномRas, активації Raf-ERK-каскадів недостатньо, щоб викликати морфологіческуютрансформацію [149]. Експресія активованого Rac надає епітеліальнисмклеткам деякі ознаки трансформованого фенотипу (в первуюочередь освіту ламеллоподія і раффлінг мембран [143,152]), проте сильна морфологічна трансформація досягається, по-видимому, тільки при спільній активації Rac-залежних і Raf-ERK сігнальнихпутей [144,153].

Про молекулярних події, відповідальних за морфологічну трансформаціюпрі активації Rac і Raf-ERK сигнальних шляхів, відомо дуже мало.Стімуляція MAP киназ ERK1 / 2 веде, як відомо, до активації рядатранскріпціонних чинників, зокрема Elk1, Fos, SRF. Зауважимо, що одним з найважливіших наслідків гіперфункції Rac є стімуляціядругого МАР кіназного каскаду (рис. 8), кінцевий продукт якого-JNK - викликає активацію транскрипційних факторів Jun і ATF2.Такім чином, і Raf-ERK-, і Rac-JNK-сигнальні шляхи регуліруютактівность транскрипційних комплексів AP-1 (складається з гомодімеровJun / Jun або гетеродімери Jun / Fos), функція яких представляетсявесьма важливою для індукції морфологічних змін. Про етомсвідетельствуют як здатність самого онкогена Jun викликати трансформаціюклеток [154,155], так і реверсія трансформованого фенотіпапрі придушенні функції Jun [156,157]. Не виключено, втім, чтотрансформірующій потенціал Jun (AP-1) пов`язаний не з прямим действіемна мішені, що регулюють адгезивні взаємодії, організаціюцітоскелета і локомоцию, а з утворенням аутокринной петлі, обусловленнойстімуляціей продукції ростових факторів / мотогенов (EGF і ін.), Які в свою чергу активують Ras і його ефектори, в частностіRac і інші GTPази сімейства Rho (Cdc42, RhoA), ответственниеза зміни морфології [155,157] (рис. 8). Так передбачається, що Rac забезпечує утворення ламеллоподія і раффлінга, Cdc42- викликає утворення філоподій, а RhoA бере участь в формірованііфокальних контактів і стрес-фібрил [143,152].

Існуючі моделі розглядають освіту ламеллоподія якнаслідок Rac-індукованого підвищення активності білка Por1 [126,152], виникнення стрес-фібрил - як наслідок актівацііміозінфосфатази під дією Rho-кінази, а освіту фокальнихконтактов - як результат зв`язування з актином цитоскелетних белковпрофіліна і гельзоліна, що стимулюється фосфатіділінозітолбіфосфатом- однією з мішеней Rho [126,152]. Поки неясно, проте, обеспечіваютсялі всі ці реакції передачею сигналів виключно між цітоплазматіческімібелкамі або зміна активності безлічі транскрипційних факторовтакже вносить свій вклад в ці процеси.

Таким чином, чільну роль в морфологічної трансформації придбанні локомо фенотипу грають, очевидно, протоонкогени, зміни активності яких призводять до активації білків семействаRas і / або його ефекторів - PI3K, Raf і, можливо, RalGDS. Мабуть, тільки сукупність викликаються ними змін в регуляції актівностіпсевдоподій, зборки / розбирання цитоскелету і фокальних контактовпрі одночасній зміні активності великого набору транскріпціоннихфакторов забезпечує зрештою придбання клітинами такзваного "повністю трансформованого" фенотипу, що визначає агресивний характер зростання. Слід, однак, враховувати, що для прояву цих змін необхідна інактивація опухолевихсупрессоров (p53 p19ARF і / або p16INK4a), що оберігають організмот появи в ньому клонів клітин з конститутивно актівірованниміRas-MAP-кіназного сигнальними шляхами. Крім того, вираженностьморфологіческой трансформації і здатності до локомоции уменьшаютсяпрі підвищенні експресії деяких інших пухлинних супрессоров- Е-кадхерина [118] і pRb [158]. Більш того, два інших важнейшіхпрізнака неопластической клітини - ослаблення контактного торможеніяразмноженія і придбання незалежності від субстрату - завісятв першу чергу від інактивації певних пухлинних супресорів (р53, p27KIP, Rb, Е-кадхерина). Тому здається очевидним, чтодля виникнення характерних для пухлинних клітин ізмененійморфогенетіческіх реакцій потрібно кілька генетичних подій (мутацій), які зачіпають і пухлинні супресори, і протоонкогени.

5. Онкогени і пухлинні супресори в неоангіогенез

Неоангіогенез - формування мережі капілярів з ендотеліальнихклеток, що вистилають дрібні венули - необхідна умова для дальнейшегороста пухлинного вузлика, який досяг в діаметрі 2-4 мм [118,159] .Придбання неопластичними клітинами здатності стімуліроватьпроліферацію і міграцію ендотеліальних клітин пов`язано, очевидно, з двома основними подіями: припиненням секреції ними чинників, що пригнічують ангіогенез (тромбоспондину і ін.), і увеліченіемпродукціі цитокінів, які є факторами росту і мотогенамі дляендотеліоцітов (в першу чергу VEGF, а також FGF, EGF, TGF-a), що супроводжується підвищенням секреції і / або активності протеаз, що забезпечують протеолиз позаклітинного матриксу та інвазію ендотеліоцітовв тканини новоутворення.

Ключову роль у виникненні ангиогенного фенотипу неопластіческіхклеток грає, мабуть, інактивація функції пухлинного супрессорар53, контролюючого експресію деяких інгібіторів і стімуляторовангіогенеза. Так, гени тромбоспондину 1 і 2 є мішеньютрансактіваціонного дії р53 [160,161], а транскпіцію генаVEGF р53, навпаки, пригнічує [162,163]. Разом зі способностьюр53 активуватися у відповідь на гіпоксію [164], це предопределяетеще один механізм, за допомогою якого нормальне функціонірованіер53 може захищати організм від пухлинного росту: гіпоксія, вознікающаяв центрі неопластического вузлика, індукує р53 і, як следствіеапоптоз або зупинку клітинного циклу, що супроводжується повишеніемсекреціі тромбоспондину і зниженням експресії VEGF, що должнопредотвращать неоваскуляризації вузлика. Природно тому, чтоінактівація р53 може бути важливим етапом в придбанні способностістімуліровать ангіогенез. Дійсно, при аналізі механізмоввознікновенія ангиогенного фенотипу в людських фібробластахбило виявлено, що в більшості випадків саме інактіваціяр53 є ініціальним подією [165].

До подальшого розвитку спроможності стимулювати ангіогенез можетпріводіть експресія онкогенів, зокрема онкогенів семействаRAS, що викликають активацію транскрипційного комплексу AP-1 і, як наслідок, з одного боку, підвищення секреції VEGF, ген которогосодержіт респонсівние елементи для АР-1 [165-169], а з іншого, - збільшення продукції ряду матриксних металопротеїназ (MMP-9 / колллагеназаIV, MMP-1 і ін.) [169-171], гени яких також регулюються AP-1 [172,173] і іншими Ras-індукованими транскрипційними факторами, зокрема Ets1 [172,173].

Слід зауважити, що послідовність подій, пріводящіхк розвитку ангиогенного фенотипу, може бути і інший: в фібросаркомаху трансгенних мишей поява ангиогенного фенотипу ініцііровалосьне мутаціями р53, а підвищенням експресії JunB і з-Jun компонентовкомплекса АР-1 і подальшим підвищенням секреції з опухолевихклеток FGFb [174] . Отримано дані про роль і інших онкогенів іопухолевих супресорів в регуляції ангіогенезу. Так, Myc подавляеттранскріпцію тромбоспондину 1 [26], тоді як пухлинний супрессорVHL, мутації якого викликають синдром фон Хиппеля-Ліндау (развітіемножественних гемангіом) і карциноми нирки [175] (табл.2), осуществляетнегатівную регуляцію експресії гена VEGF в стромальних клеткахгемангіом [176] і клітинах ниркового епітелію [177]. Таким чином, очевидно, що зміни активності певних пухлинних супрессорові онкогенов грають вирішальну роль в стимуляції ангіогенезу.

6. Роль онкогенов і пухлинних супресорів в придбанні способностік метастазування

Метастазування - утворення вторинних вогнищ пухлинного росту-найнебезпечніший прояв прогресії новоутворень, являющеесяосновной причиною смерті онкологічних хворих. Щоб дати метастаз, клітина повинна придбати ряд властивостей: вміння проникати в глубінуокружающіх нормальних тканин (у тому числі в кровоносні або лімфатіческіесосуди), здатність виживати після потрапляння в судини, а затемпенетріровать їх і розмножуватися в невластивому для даного тіпаклеток мікрооточенні, даючи нове вогнище пухлинного росту [118] Таким чином, здатність до метастазування складається ізкомплекса простіших ознак, значна частина яких-придбання локомо фенотипу і підвищеної протеолітіческойактівності, здатність стимулювати ангіогенез і створювати темсамим шляхи евакуації пухлинних клітин з первинного вогнища, вознікновеніенезавісімості від субстрату і придушення апоптозу, - вже була рассмотренав попередніх розділах. Поява кожного з цих ознак увелічіваетвероятность розвитку метастатичного потенціалу. Однак Найбільш важливий представляються гени і білки, такі, наприклад, як р53, Ras і Src, зміни активності яких призводять до вознікновеніюсразу декількох компонентів метастатичного фенотипу, а, крометого, - до генетичної нестабільності, що полегшує поява дополнітельнихпрізнаков, необхідних для метастазування. Цікаво, що р53, порушення функції якого істотно збільшують способностьклеток давати метастази в модельних системах in vivo [58,178,179], крім усього іншого прямо активує транскрипцію недавно откритогогена KAI1 [180] - трансмембранного білка, що утворює комплексис Е-кадхерін. Втрата експресії білка KAI1, обумовлена втому числі і інактивацією р53 [180], закономірно обнаружіваетсяв різних пухлинах людини на пізніх стадіях захворювання (60-90% випадків раку передміхурової, підшлункової та молочної залоз, мелкоклеточногорака легкого, гепатоцелюлярного раку і ін.) [181- 185], а восстановленіеего експресії викликає пригнічення метастатичного процесу [186-188]. Кальційзв`язуючий білок S100A4 / MTS1 / CAPL (метастазін), навпаки, гіперекспрессіруют на пізніх стадіях розвитку разлічнихновообразованій людини [189] і має здатність прідаватьклеткам інвазірует і метастатичний потенціал [190-192]. Егоекспрессія також викликає плейотропний ефект: вона призводить дозменшення вмісту Е-кадхерина [193], придушення синтезу інгібітораметаллопротеіназ TIMP-1 [194], змін регуляції динаміки реорганізаційцітоскелета в результаті інгібування фосфорилювання тяжелойцепі міозину [195] і, можливо, до секвестрування і функціональнойінактіваціі р53 [ 189].

Зрозуміло, описані вище зміни не вичерпують переченьконтроліруемих пухлинними супрессорами і / або протоонкогенаміпрізнаков, які можуть відігравати суттєву роль в пріобретенііспособності до метастазування. Так, значний інтерес представляетопісанний Г.І.Дейчман так званий "H2O2CA + PGES"-фенотіп, що полягає в підвищенні антиоксидантних активностей, секрецііпростагландіна E2 і, як наслідок, в придбанні ще большейустойчівості до факторів природної протипухлинної резистентності набутого імунітету [196,197]. Цей фенотип індуціруетсяв культивованих in vitro клітинах шляхом трансдукції определеннихізоформ онкогена v-src, але не іншими дослідженими генами (актівірованнийH-ras, myc, bcl2, мутантний р53, E1A, LT SV40) або виникає впроцессе зростання пухлини in vivo, причому метастатична способностьклеток корелює з його. Очевидно, в найближчі роки нас чекають інші важливі знахідки, що проливають світло на механізми метастазірованіяі роль в цих процесах пухлинних супресорів і онкогенів.