Медичне законодавство: права, документи, обов`язки, норми, акти.

УтверждениГлавним государственнимсанітарним врачомРоссійской Федерації -Перший заместітелемМіністра здравоохраненіяРоссійской ФедерацііГ.Г.ОНІЩЕНКО9 січня 1998 годаДата введення - 8 червня 1998 года4.2. Методи контролю. Біологічні МІКРОБІОЛОГІЧНІ ФАКТОРИЛАБОРАТОРНАЯ ДІАГНОСТИКА дифтерійно ІНФЕКЦІІМЕТОДІЧЕСКІЕ УКАЗАНІЯМУ 4.2.698-981. Розроблено співробітниками Федеральної референс - лабораторіідіагностікі дифтерійній інфекцііМосковскогонаучно-дослідного інституту епідеміології та мікробіології ім.Г.Н. Габричевского (д.м.н. Мазуровой І.К., к.м.н. Мельниковим, к.б.н. Комбарови С.Ю., Борисової О.Ю.) і ДепартаментомГоссанепіднадзора МОЗ Росії (Жилиной Н.Я. ) .2. Затверджено і введено в дію головним государственнимсанітарним лікарем Російської Федерації, першим заместітелемМіністра охорони здоров`я Російської Федерації від 8 квітня 1998 р. 3. ВведенивзаменМетодіческіхуказаній4.2.589-96"Лабораторна діагностика дифтерійній інфекції".1. Область прімененіяМетодіческіе вказівки складені на допомогу спеціалістамбактеріологіческіх лабораторій санітарно - епідеміологічоскойслужби, лікувально - профілактичних закладів та науково-дослідних інститутів для вдосконалення лабораторнойдіагностікі дифтерійній інфекціі.2. Характеристика збудника дифтерійній інфекцііВозбудітелем діфтерійнойінфекцііявляются токсігенниеCorynebacterium diphtheriae. Нетоксігенние коринебактерии діфтерііне викликають дифтерійну інфекцію. "етіологічна" значимість етіхмікроорганізмов при неінфекційної патології (фарингіт, артрит, ендокардит та ін.) вимагає спеціальних доказів. При виделеніінетоксігенних штамів С.diphtheriae від хворих з підозрою надіфтерійную інфекцію слід звернути увагу на правільностьпроведенія бактеріологічного дослідження і оцінку токсігеннихсвойств.В основі здатності С. diphtheriae виробляти екзотоксінлежіт феномен фаговой (або лізогенной) конверсії. Конверсіянетоксігенних штамів С. diphtheriae в токсигенні і наоборотвоспроізводітся тільки в особливих, експериментальних умовах. У тих випадках, коли при первинному посіві досліджуваного матеріалу отбольних дифтерію виділяють токсигенні, а при повторнихобследованіях після лікування антибіотиками - нетоксігенниекорінебактеріі дифтерії, можна припустити, що при іспользованііантібіотіков в першу чергу зникають токсигенні штами, какболее чутливі до їх дії, а нетоксігенние штаммипродолжают виділятися. Таке ж становище може створюватися і прісанаціі антибіотиками бактерієносіїв, одночасно виделяющіхтоксігенние і нетоксігенние коринебактерии дифтерії. Виявлення Утаки носіїв при повторних обстеженнях тільки нетоксігеннихштаммов не можна трактувати як втрату здатності штаммовпродуціровать екзотоксін.Таксономіческі близькими увазі С.diphtheriae є C.ulceransі C.pseudotuberculosis (C.ovis). Дані мікроорганізми - пріродниепатогени великої та дрібної рогатої худоби, коней. Отмеченаспособность цих видів бактерій виробляти токсин, подобнийдіфтерійному. зустрічаються і "нетоксігенние" штами. Ізвестнислучаі виділення "токсигенних" C.ulcerans при клінічній картінезаболеванія, подібна до діфтеріей.На слизових оболонках ротоглотки та носа в нормі частовстречаетсяложнодіфтерійнаяпалочка Гофмана (C.pseudodiphtheriticum). Уміння виділяти і ідентіфіціроватьданние бактерії служить критерієм оцінки якості работибактеріологов в межепідеміческій період.Все мікроорганізми роду Corynebacterium являютсяграмположітельнимі паличками, що не утворять суперечка, обладающіміразлічной ступенем поліморфізму. Більшість видів краще росте ваеробних условіях.Обично колонії мікроорганізмів з роду коринебактерій наплотних поживних середовищах (наприклад, на кров`яному агарі) імеютсеровато - білу або жовтувату забарвлення, непрозорі іліполупрозрачние, округлої форми, діаметром 1 - 3 мм. Найчастіше онібивают м`якою, маслянистої консистенції, хоча деякі види родакорінебактеріімогутобразовивать шорсткі R-колоніі.Представітелі цього роду не відрізняються високою ферментатівнойактівностью. C.diphtheriae ростуть при 37ш C, стійкі до нізкойтемпературе, чутливі до високої. Всі дезінфікуючі веществав звичайних концентраціях (3 - 5%) знищують корінебактеріідіфтеріі протягом 20 - 30 хвилин. Токсигенні C.diphtheriae болеечувствітельни до антибіотиків, ніж нетоксігенние. Возможнопоявленіе стійких до антибіотиків штамів. Широко определятьчувствітельностькантібіотікам штамів, виділених отбактеріоносітелей, не слід через невідповідність результатовлабораторной проби з дією антибіотиків на возбудітелядіфтеріі в організмі человека.Для C.diphtheriae характерний значний поліморфізм -Різноманітність розмірів і форми клітин. Клітини мають форму булави, ракетки, гедзів і т.д. Взаиморасположение клітин нагадує рімскіеціфри X, V. При фарбуванні часто виявляється вираженнаявнутріклеточная смугастість, що пояснюється наявністю зеренволютіна. Описано спорідненість волютина до метиленового синього і, пріобработке цим барвником, гранули або смужки (скупчення гранул) фарбуються в синій колір, а протоплазма в окремих случаяхможет придбати розовийоттенок.Іспользованіевбактеріологіческой практиці окраскіпоГрамуявляетсянецелесообразним, посколькуклеткіC.diphtheriaeлегкообесцвечіваются спіртомімогутвиглядетьвмазкеграмваріабельнимі або навіть грамотріцательнимі.Для C.ulcerans і C .pseudodiphtheriticum характерна склонностьк паралельного розташуванню клітин. 24 - 48-годинні культури етіхвідов мають найчастіше овоидную форму клеток.По формі колоній і деяким біохімічним свойствамC.diphtheriae поділяють на культурально - біохіміческіеваріанти - gravis, mitis, intermedius.Через 48 - 72 години росту варіант mitis утворює колонііS-типу - гладкі, діаметром 1 - 2 мм-SR-колонії варіанти gravisобично опуклі, з піднятим центром, діаметром 2 - 3 мм-колонії варіанти intermedius - S-типу, дрібні, плоскі, гладкі, зрівняна краєм, діаметром 0,5 - 1 мм. Далі описуються тільки двакультурально - біохімічних варіанти - gravis і mitis, так какбіовар intermedius зустрічається рідко і за біохімічними свойствамна відрізняється від биовара mitis.На кров`яних телуритовий середовищах через 48 годин росту колонііC.diphtheriae варіанту gravis, як і колонії C.ulcerans, чорні, матові мають радіальну смугастість. КолонііC.pseudodiphtheriticum мають характерний світлий ободок.В бактеріологіческойпрактікеопіратьсятолько наморфологіческіе властивості колоній або мікробної клітини, пріідентіфікаціі C.diphtheriae, не представляється можливим. Опісанислучаі бактеріологічної гіпо- та гіпердіагностики (в 55% і 14,5% випадків відповідно), коли використовується учеттолькоморфологіческіх ознак. При ідентифікації C.diphtheriaeнеобходімо використовувати комплекс тестів, в першу чергу, визначення патогенності (токсигенности), основного прізнакавозбудітеля діфтеріі.Определеніе токсигенних властивостей проводиться бактеріологами вперше добу росту підозрілих колоній на чашках первічногопосева матеріалу. Щоб уникнути помилок при визначенні токсігеннихсвойств коринебактерий, необхідно вивчати даний ознака умаксімального числа колоній, що виросли з чашок первинного посева.Прі дотриманні описаних нижче методик можна вивчити токсігенностьболее ніж у 20 підозрілих колоній з одного аналізу. Нельзяізучать матеріал при множині зростанні підозрілих колонійтолько в одній - двох бляшках.Ферментатівная активність мікроорганізмів вивчається путемопределенія ферментів цистиназу, уреази, здатності розщеплювати докіслоти глюкозу, сахарозу, крохмаль. У рідкісних випадках, когданеобходімо ідентифікувати C.ulcerans, додається тест навосстановленіе нітратів в нітріти.Учітивая, що при ідентифікації збудника діфтерійнойінфекціі провідним елементом є визначення наявності токсину, оценкідругіхсвойствімеет допоміжне значеніе.Іспользованіе "довгого" вуглеводного ряду є зайвим пріідентіфікація C.diphtheriae.Практіческімбактеріологам, які займаються лабораторною діагностикою дифтерії, які не требуетсяпроводіть ідентифікацію до виду інших мікроорганізмів родаCorynebacterium. У той же час, в лабораторіях, де проводітсядіагностіка захворювань, що викликаються "недіфтерійнимі"коринебактериями, недостатньо використання навіть "довгого"вуглеводного ряду. Для точної ідентифікації даних мікроорганізмовнеобходімо використовувати хемотаксономіческіе методи дослідження, наприклад, такі, як визначення наявності міколових кислот всоставе клітинної стінки бактерій і деякі другіе.Такім чином, виділений мікроорганізм є возбудітелемдіфтеріі, якщо він володіє токсигенними властивостями, определеннимспектром ферментативної активності (розщеплення глюкози, крохмалю, відсутність розкладання сахарози, наявність ферменту цистиназу, відсутність ферментауреази) і характерними морфолого -культуральнимі ознаками (освіта колоній чорного або серогоцвета на кровяно - телуритовий середовищах, з урахуванням, за необхідності, морфології клітин - поліморфні, що не утворюють спорпалочкі) .3. Бактеріологічне ісследованіеБактеріологіческое дослідження проводять з метою лабораторнойдіагностікі дифтерійній інфекції, виявлення джерел інфекції інаблюденія за поширеністю токсигенних корінебактеріідіфтеріі.ВЗЯТІЕ І ДОСТАВКА матеріалу1. Успіх бактеріологічного дослідження в значітельнойстепені залежить від своєчасного і правильного взяття матеріала.2. Взяття матеріалу повинні проводити спеціально обученниемедіцінскіе працівники лікувально - профілактичних учрежденій.3. При дослідженні на дифтерію обстежують ротоглотку і нос.Прі дифтерії рідкісних локалізацій (око, вухо, рана, шкіра, піхву) крім уражених ділянок, слід брати матеріал також сміндалін і з носа.4. Взяття матеріалу здійснюють за допомогою стерильних ватнихсухіх тампонів. Для їх приготування використовують дерев`яні іліметалліческіе (з нержавіючого металу) палички, на один з концовкоторих щільно накручується шар гігроскопічної вати (прімерно120 мг вати на тампон). Тампони повинні мати форму "краплі", а не"веретена". Тампони монтують в пробірки з корковими або ватниміпробкамі так, щоб кінець тампона не торкався дна і стенокпробіркі. Стерилізують тампони в сухожарові шафі при температуре140ш C протягом години або в автоклаві при 0,5 атм. 30 мін.5. Матеріал з ротоглотки і носа беруть окремими тампонами, натщесерце або не раніше, ніж через дві години після їжі, при хорошемосвещеніі, з використанням шпателя, не торкаючись тампоном мови івнутренніх поверхонь щік і зубів. Одним тампоном собіраютматеріал з уражених ділянок ротоглотки - мигдалин, а за необхідності - з дужок м`якого піднебіння, піднебінного язичка або заднейстенкі глотки. При наявності нальотів, матеріал слід брати сграніци уражених і здорових тканин, злегка натискаючи на ніхтампоном. Для взяття матеріалу з носа використовують інший тампон, який вводять спочатку в один, а потім в інший носовий хід, Некас крил носа снаружі.6. При ларингоскопії матеріал (слиз, плівка) собіраютнепосредственно з гортані. Матеріал з уражених ділянок кожіследует збирати сухим тампоном після видалення кірочок або струпа.7. Тампони повинні битьдоставлени в лабораторіюнепозднее 3-х годин з моменту взяття матеріалу. При проведенііобследованія контингентів у віддалених від бактеріологіческіхлабораторій районах, рекомендується засівати матеріал на чашки спітательной середовищем або використовувати транспортну среду.8. У разі використання транспортного середовища матеріал собіраютсухім тампоном, опускають в пробірку з середовищем і стежать за тим, щоб пробка тампона НЕ намокла. Слід враховувати, що прімененіетранспортной середовища збільшує термін видачі остаточного ответана одні суткі.9. Чашки (або пробірки з транспортним середовищем) з посевомісследуемого матеріалу можна помістити для підрощування втермостат при 37ш C на 15 - 18 годин, після чого доставити влабораторію.10. При транспортуванні на далекі відстані також можноиспользовать тампони, попередньо просочені растворомгліцеріна. Тампон просочують 5-процентним розчином гліцерину вдістіллірованной воді, віджимають об стінки судини з розчином, зміцнюють в пробірці так само, як сухий тампон і автоклавують прі0,5 атм. протягом 30 мін.11. Холодна пора року досліджуваний матеріал доставляють вбаклабораторію в сумках - термосах, щоб уникнути його замерзанія.12. Вслучаенеобходімості проведення постмортальнихісследованій на коринебактерії дифтерії, матеріал целесообразнобрать з мигдалин, гортані і порожнини носа, оскільки у внутренніхорганов збудник виявляється редко.13. Кожній пробірці з досліджуваним матеріалом (зів, ніс абоіншої локалізація) надається номер. У доданому спіскеуказивается номер пробірки, прізвище, ім`я (або ініціали), вік, назва установи, що направляє матеріал, або домашній адресобследуемого, мета обстеження (діагностична з указаніемдіагноза, за епідпоказаннями, профілактичне обстеження), дата час взяття матеріала.ХОД ДОСЛІДЖЕННЯ. ПЕРШИЙ ДЕНЬПосев матеріала.Матеріал для дослідження з ротоглотки, носа або другіхпораженних місць засівають окремо на поверхню однієї ізрекомендуемих щільних поживних середовищ, розлитих в чашки Петрі.Посев від однієї особи роблять на одну чашку, використовуючи прицьому половину поверхні середовища для посіву матеріалу ізротоглоткі, а другу - для посіву матеріалу з носа. При посевематеріала з шкіри або інших місць додають ще одну чашку. Не допускається посів матеріалу від кількох осіб на одну чашку.Прі посіві матеріал втирають в середу з усіх боків тампона научастке площею 2 x 1 кв. см - формування такої "майданчики"є обов`язковим. Потім цим же тампоном засівають оставшуюсяповерхность 1/2 чашки. Посів роблять частими неперекривающімісяштріхамі, не відриваючи тампон від поверхні живильного середовища і незмінне положення тампона. Такий метод посіву дозволяє засеятьвесь матеріал з тампона, отримати ізольовані колонії (чістуюкультуру) для подальшої ідентифікації безпосередньо на чашкепервічного посіву, що скорочує тривалість аналізу на однісуткі. Засіяні чашки або пробірки з транспортним середовищем помещаютв термостат при 37ш C. Висів з транспортної середовища виробляють наследующие добу на щільну живильне середовище тампоном, віджатим остенкі пробірки, або петлею, забираючи матеріал з осадка.Посев слід проводити на чашки із середовищем, зігріті прікомнатной температурі або в термостаті (15 - 20 хвилин) Друге день1. Колонії, що виросли на чашках, переглядають через 24 часапосле посіву матеріалу (якщо матеріал засівали у другій половінедня, то перегляд здійснюється рівно через 24 години, тобто теж Піддругій половині дня) візуально або за допомогою мікроскопабінокулярного стереоскопічного (МБС) .2. Чашки з колоніями, схожими на дифтерійні, відбирають длядальнейшего ідентифікації культури за всіма тестами. Мікроскопііпрепаратов - мазків з "підозрілих" колоній можна непроводіть. "підозрілі" колонії на кровяно - теллурітовихсредах через 24 години росту світло - сірого кольору, опуклі, зрівняна краями, через 48 годин - сірі з металевим відтінком, сровниміілі злегка порізаними краями, кришаться пріпрікосновеніі петлею або м`якої консистенції. з "сумнівних"колоній готують препарати - мазкі.Клеткі коринебактерий дифтерії з культури, що виросла на средахс інгібіторами росту (телурит калію, хінозол) можуть битьукорочени, потовщені, проте притаманне розташування і поліморфізмсохраняются. Оцінка морфологічних ознак НЕ позволяетустановіть видову приналежність мікроорганізму, але даетвозможность імовірно віднести його до роду корінебактерій.Еслі при мікроскопії виявляють палички, характерні для родакорінебактерій, то ці колонії відбирають для дальнейшейідентіфікаціі за всіма тестами. У разі виявлення інших форммікроорганізмов (коків, дріжджів, спорових паличок), дальнейшееізученіе цих колоній прекращается.3. У разі зростання "підозрілих" однотипних колоній, необхідно відразу ж приступити до вивчення їх токсигенних свойств.Токсігенние властивості вивчають не менше ніж у 2 ізолірованнихколоній шляхом посіву однієї половини кожної колонії на середу дляопределения токсигенности і, необпалених петлею, - на середу Пізу, а іншої половини колонії - в пробірку зі скошеним сивороточнимагаром для збереження та накопичення культури. При невозможностіснять 1/2 колонії для посіву на токсигенность і на середу Пізуіспользуется матеріал цілої колонії-посів на скошений агарісключается і, в подальшому, використовується культура з пробірки Спроба Пізу. З огляду на, що через 24 години росту колонії імеютнебольшіе розміри і матеріалу 1/2 або 1 колонії може битьнедостаточно для накопичення дифтерійного токсину в пробі натоксігенность, а також те, що в досліджуваному матеріалі могутнаходіться одночасно токсигенні і нетоксігенние разновідностікорінебактерій дифтерії, вкрай важливо вивчити токсігенниесвойства, по можливості, у максимального числа колоній, що виросли (20 і більше), змішуючи по 5 - 7 однотипних колоній в одну бляшку.4. При неможливості постановки проби на токсігенностьклассіческім способом (див. П. 3) через недостатню велічіниколоній, їх вивчають, змішуючи однотипні колонії в несколькіхбляшках. Чи не пропалюючи петлі, проводять посів у середу Пізу. Чашки спервічним посівом досліджуваного матеріалу знову поміщають втермостат на 24 години і переглядають їх повторно (на третьісуткі) .5. Якщо виростає тільки одна колонія, її можна засіяти насреду для визначення токсигенності і, не обпалюючи петлі, в столбіксреди Пізу для визначення цистиназу. Для подальшої ідентіфікацііможно використовувати культуру з пробірки з пробою Пізу або з бляшкічерез 48 годин росту, або через 24 години росту при виявленнихтоксігенних властивості культури.6. З метою видачі попереднього відповіді, в случаемножественного зростання підозрілих колоній, можна проізвестіпосев кількох колоній на рідку живильне середовище дляпостановкі РНГА, поповнити додаткову пробу Закса (3 -5 однотипних колоній, облік через 30 хв. Інкубації) і пробу Пізу (5 - 6 однотипних колоній , облік через 3 години інкубації). Пріхарактерной для коринебактерій дифтерії морфології колоній в МБС, морфології клітин при мікроскопії, негативній пробі Закса, позитивних результатах проби Пізу, РНГА, можна видатьпредварітельний відповідь про виявлення культури, підозрілої накорінебактеріі дифтерії через 48 годин (на третю добу) з моментапервічного посіву досліджуваного матеріала.ТРЕТІЙ ДЕНЬ 1. Через 24 години, при появі специфічних лінійпреціпітаціі на середовищі для визначення токсигенності, положітельнойпробе на цистиназу, досліджувану культуру ідентифікують каккорінебактерій дифтерії токсигенні і видають документірованнийответ.Прі відсутності специфічних ліній преципітації на середовищі дляопределения токсигенности, чашки інкубують ще 24 часа.2. Культуру, що виросла на скошеному сироватковому агарі або Спробуй Пізу (після оцінки її чистоти), засівають на середовища дляопределения біохімічного варіанту (сахароза, глюкоза, крохмаль) іфермента уреази (гідроліз сечовини) .3. Чашки з первинним посівом ісследуемогоматеріалапросматрівают візуально або за допомогою МБС повторно через 36 -48 годин інкубації в термостаті. При наявності "підозрілих"колоній вивчають їх токсигенні властивості, цістіназную активність івиделяют чисту культуру на скошеннийсивороточний агар (див. другий день дослідження, п. 3) .При відсутності колоній, підозрілих на корінебактеріідіфтеріі, видають остаточну відповідь, що коринебактерії діфтерііне виявлени.Прі відсутності зростання на чашках первинного посіву через48 годин інкубації, в ряді випадків потрібне повторне взяття иисследовании матеріалу. Повна відсутність зростання частіше всегосвідетельствуетонарушенііправілбактеріологіческогообследованія (взяття, доставки, посіву і культівірованіяісследуемого матеріалу) .ЧЕТВЕРТИЙ ДЕНЬ (АБО П`ЯТИЙ) 1. При появі специфічних ліній преципітації на середовищі дляопределения токсигенности (через 24 години інкубації проби натоксігенность 48-годинного росту первинного посіву), положітельнойпробе на цистиназу видають документований відповідь про виделеніітоксігенних коринебактерий діфтеріі.2. Культуру, що виросла на скошеному сироватковому агарі або Спробуй Пізу, після визначення її чистоти, засівають на середовища длявивчення біохімічних властивостей (середовища Гіссен з сахарозою, глюкозою, крохмалем, проба Закса або бульйон з сечовиною) .3. Повторно (через 48 годин) враховують результати проби натоксігенность, поставленої в 2 день дослідження. Одновременнопроізводят облік сахаролитических властивостей і уреазний активності впробах, поставлених в 3 день ісследованія.Прі відсутності специфічних ліній преципітації через 48 часовпосле постановки проби на токсигенность, але при положітельнихрезультатах проб на цистиназу, глюкозу, негативних результатахпроб на уреазу і сахарозу, культуру ідентифікують каккорінебактеріі дифтерії нетоксігенние, із зазначенням біохіміческоговаріанта.Прі виділення токсигенних коринебактерій діфтеріідополнітельно видають відповідь про біохімічні властивості (через 72 ілі96 годин з моменту первинного посіву досліджуваного матеріалу) .БАКТЕРІОЛОГІЧЕСКОЕ ЗАКЛЮЧЕНІЕ1. Наявність специфічних ліній преципітації при определеніітоксігеннихсвойств, позитивна проба на цистиназу, негативна проба на уреазу, характерні культуральні ібіохіміческіе властивості (сахароза, глюкоза, крохмаль) позволяютзаключіть, що виділена культура належить до виду корінебактерійдіфтеріі, токсигенних, біохімічного варіанту гравіс або мітіс.2. Відсутність специфічних ліній преципітації при определеніітоксігеннихсвойств, позитивна проба на цистиназу, негативна проба на уреазу, характерні культуральні ібіохімічекіе властивості дозволяють зробити висновок, що виділена культураотносітся до виду коринебактерий дифтерії, нетоксігенним, біохімічного варіанту гравіс або мітіс.3. При наявності ліній преципітації, ідентичних спеціфіческімлініям контрольного штаму коринебактерій дифтерії, положітельнихпроб на уреазу, цистиназу, ферментації глюкози і крохмалю, відсутності ферментації сахарози, відсутності редукції нітратів внітріти, культуру відносять до виду коринебактерий ульцеранс, токсігенний варіант.Прі відсутності ліній преципітації при визначенні токсігеннихсвойств і наявності всіх інших ознак, характерних длякорінебактерій ульцеранс, нетоксігенним варіант, ібактеріологіческій відповідь вважають отріцательним.4. При виділенні коринебактерій Гофманаілідругіхдіфтероідов, бактеріологічний відповідь вважають отріцательним.5. У деяких випадках, при діагностичному обстеженні та поепідпоказаніям, може бути виданий попередній відповідь. Етотребует постановки додаткових проб, наявності качественнихпітательних середовищ, тест - системи для постановки РНГА і спеціальнообученного персоналу. Попередню відповідь може бути виданий приналичии множинного зростання однотипних "підозрілих" колонійна чашках первинного посіву після 24 годин інкубації (див. второйдень дослідження, п. 6) .Предварітельний відповідь може бути змінений після окончаніябактеріологіческого ісследованія.6. Штами коринебактерий дифтерії з атіпічниміморфологіческімі, біохімічними, токсигенними властивостями іштамми коринебактерий ульцеранс слід направляти в федеральнуюреференс - лабораторію з діагностики дифтерійної інфекції пріМосковском НДІ епідеміології та мікробіології ім.Г.Н. Габричевского для подальшого вивчення, (125212 Москва, вул. Адмірала Макарова, 10) Схеми БАКТЕРІОЛОГІЧНОГО дослідження1 деньПосев ісследуемогоматеріала на селектівнуюдіфференціально - діагностичну або, при необхідності, втранспортную середу. Інкубування в термостаті при 37ш C.2 день (24 години) 1. Вивчення колоній, що виросли, при можливості - постановкапроби на токсигенность, цистиназу і посів культури на скошеннийсивороточний агар.2. При використанні транспортного середовища необхідно проізвестіпересев на селективну диференційно - діагностичну среду.3. При множині зростанні, в разі необхідності, можнопровесті дослідження для видачі попереднього відповіді -Додаткові проби Пізу, Закса і посів "підозрілих" колонійв рідку живильне середовище для виявлення дифтерійного токсину вРНГА.3 день (48 годин) 1. Облік результатів проб на токсигенность і на цистиназу, поставлених у другий день дослідження. У разі налічіяспеціфіческіх ліній преципітації і при позитивній пробі Пізувидаютдокументірованнийответ про виділення токсігеннихкорінебактерій діфтеріі.2. Посів чистої культури, виділеної в другій деньісследованія, на середовища Гіссен для вивчення біохімічних властивостей (сахароза, глюкоза, крохмаль, сечовина) .3. Повторний перегляд (через 48 годин) чашок первинного посевавізуально або за допомогою МБС. Постановка проб на токсигенность, цистиназу і відсів колоній на скошений сироватковий агар.4. У разі використання транспортного середовища, хід ісследованіясм. починаючи з п. 1 другого дня і далі по схеме.5. Видачабактеріологіческогоответаоботсутствіікорінебактерій діфтеріі.6. При постановці РНГА для виявлення дифтерійного токсину, приналичии позитивного результату в цій реакції і виявленні уісследуемой культури ферменту цистиназу, відсутності ферментауреази, можна видати попередню відповідь про виділення возбудітелядіфтеріі.4 день (72 години) 1. Облік токсигенних властивостей культури, виділеної в 3 деньісследованія (через 48 годин росту первинного посіву), і видачадокументірованного відповіді про виділення токсигенних корінебактерійдіфтеріі. Посів виділеної культури для визначення біохіміческіхсвойств (сахароза, глюкоза, крохмаль, сечовина) .2. Облік біохімічних властивостей культури (токсигенной ілінетоксігенной), виділеної в другий день дослідження (через24 години інкубації первинного посіву) .Видача бактеріологічного відповіді про виділення нетоксігеннихкорінебактерій дифтерії із зазначенням біохімічного варіанту ідодаткові відповіді про біохімічні властивості токсігеннихкорінебактерій дифтерії, виділених ранее.5 день (96 годин) видача бактеріологічного відповіді про виділення (через 48 часовінкубаціі первинного посіву) токсигенних або нетоксігеннихкорінебактерій дифтерії із зазначенням біохімічного варіанта.4. Методики ідентифікації збудника діфтерійнойінфекцііОПРЕДЕЛЕНІЕ Токсигенні ВЛАСТИВОСТЕЙ КОРІНЕБАКТЕРІЙДІФТЕРІІ ЗА ДОПОМОГОЮ РЕАКЦІЇ преципітації в основі гелю методу визначення токсигенності корінебактерійдіфтеріі (тест Елека) лежить процес зустрічній іммунодіффузіітоксіна і антитоксичних антитіл в щільному живильному середовищі. Разом оптимального кількісного співвідношення між токсином, що продукується коринебактериями, і антитоксином, нанесеним нафільтровальную папір, відбувається їх взаємодія з образованіемпреціпітата у вигляді білої лінії або "вусів".Токсігенность Коринебактерий дифтерії визначають, як правило, в чистій культурі (окремі колонії або культура зі скошенногоагара, або з проби Пізу). Суміш колоній або культури, загрязненниепостороннеймікрофлорой, також можуть бути випробувані натоксігенность. При відсутності, в цьому випадку, преципитатов вагаровом гелі, досвід слід повторити з виділеними чістимікультурамі.Для постановки проби на токсигенность необхідно мати: стерильні чашки Петрі з рівним дном, живильне середовище - агарМартена або суху комерційну живильне середовище, нормальнуюсиворотку крові великої рогатої худоби, стерильні смужки ізфільтровальной паперу розміром 1,5 см x 8 см, очіщеннийферментолізом і специфічної сорбції дифтерійний антитоксин (вдальнейшем іменується антитоксин), протіводіфтерійнуюантітоксіческую сироватку кінську, лікувальну (в дальнейшеміменуется антитоксическая сироватка), або готові паперові діскіс нанесеним на них антитоксином, а також - контрольнийтоксігенний штам коринебактерий дифтерії 24 - 48-годинного роста.Пріготовленіе чашок для постановки пробина токсігенностьПітательний агар для визначення токсигенності целесообразноразлівать в пробірки по 10 мл (кількість, необхідна дляпріготовленія однієї чашки). При великому обсязі роботи пітательнийагар розливають у флакони по 70 - 80 мл (на 7 - 8 чашок проби натоксігенность). Поживний агар слід расплавлівать только1 раз- багаторазове плавлення погіршує властивості середовища. Пітательнийагар расплавлівают в водяній бані при 90ш C, негайно ж виймають ізбані, охолоджують до 50Ш C і додають 20% сироватки крупногорогатого худоби. Так, до 10 мл поживного агару додають 2 млсивороткі великої рогатої худоби, перемішують і виливають, дотримуючись правил асептики, в стерильну чашку Петрі, распределяютсоседу по дну обережним обертанням чашкі.В центр чашки на поверхню застигає агару обожженнимпінцетом поміщають смужку з фільтрувального паперу, пропітаннуюантітоксіном ( або антитоксической сироваткою) .Чашку підсушують в термостаті при 37ш C протягом 15 -20 хв., повернувши її догори дном. При використанні бумажнихіндікаторних дисків, чашку з поживним агаром підсушують донанесенія дисків на поверхню среди.Чашкі із середовищем для визначення токсигенності зберігати нерекомендуется.Пріготовленіе паперових полосокПолоскі фільтрувального паперу нарізають розміром 1,5 см x 8 см, загортають по 2 - 4 штуки в пакетик і стерилізують в автоклавепрі 0,5 атм протягом 30 хв. Пакетики з паперовими полоскаміхранят в стерильній чашці Петрі до 3 недель.Перед постановкою проби на токсигенность вміст ампули сантітоксіном розчиняють в 1 мл стерильного фізіологіческогораствора, переносять в стерильну пробірку і вказують на нейдан етикетки (розчинений антитоксин зберігають при температуре4 - 6ш C не більше 10 днів) . Фільтрувальні папірці обожженнимпінцетом поміщають в стерильну чашку Петрі. На кожну полоскунаносят 0,25 мл антитоксина, що містить 500 ME в 1 мл. Дляудаленія надлишку сироватки змочену смужку прикладають кстерільной кришці чашки Петрі.Прі використанні антитоксичної сироватки (вместоантітоксіна), потрібно її розведення до 500 ME в 1 мл.Разведеніе антитоксической сивороткіСоблюдая правила асептики, антитоксичну сироватку переносятіз ампули в стерильну пробірку. На пробірці вказують данниеетікеткі і термін зберігання. Зберігають сироватку при температурі 4 -6ш C.Сиворотка повинна бути розлучена стерильним фізіологіческімраствором до змісту 500 ME в 1 мл. Комерційний препарат можетіметь різну активність (5000 ME, 10000 ME, 20000 ME) і разлічнийоб`ем.Напрімер, в ампулі міститься 10000 ME (у обсязі 4,8 мл, какуказано на етикетці коробки з ампулами) антитоксической сивороткі.Для спрощення розрахунків загальний обсяг сироватки можна прийняти за5 мл. Отже, в 1 мл сироватки містить 2000 ME (10000 ME: 5 = 2000 ME). Щоб отримати 500 ME в 1 мл, следует1 мл сироватки розвести в 4 рази, тобто до 1 мл сироватки добавіть3 мл стерильного фізіологічного розчину. При необходімостіможно розвести сироватку в менших обсягах: до 0,1 мл сивороткідобавіть 0,3 мл фізіологічного розчину або до 0,2 мл сивороткідобавіть 0,6 мл фізіологічного розчину, або до 0,3 мл сивороткідобавіть 0,9 мл фізіологічного розчину і т. д.Разведеніе сироватки можна виконати іншим способом. Якщо, наприклад, в ампулі міститься 5000 ME сироватки в обсязі 2,5 мл, то 500 ME міститься в 025 мл сироватки. До цього обсягу добавляют0,75 мл стерильного фізіологічного розчину і получаютразведеніе сироватки 500 ME в 1 мл.Разведенную сироватку можна зберігати до 7 днів при температуре4 - 6ш C.ПОСТАНОВКА ПРОБИКультуру засівають у вигляді "бляшок" діаметром 0,6 - 0,7 см навідстані 0,7 - 0,8 см один від одного і 0,5 см від краю полоскіфільтровальной паперу. На одну чашку слід засівати НЕ більше10 "бляшок". З них 6 "бляшок" випробуваної культури, 4 -Контрольний штаму. При невеликій кількості іспитуемогоматеріала засівають 6 контрольних "бляшок" і 4 - випробовуваних (рис. 1 lt; * gt;). Чашки з посівом поміщають в термостат при 37ш C .-------------------------------- lt; * gt; Чи не пріводітся.Учет результатовРезультат враховують через 18 - 24 години і 48 годин роста.Следует мати на увазі, чтопрепаратантітоксіческойпротіводіфтерійной сироватки, крім антитіл до діфтерійномуантітоксіну, містить антитіла до антигенів мікробної клеткі.Поетому при постановці проби на токсигенность з іспользованіемданного препарату преципітати можуть утворюватися не тільки врезультаті зв`язування токсину з антитоксином (спеціфіческіепреціпітати), але і при взаємодії антибактеріальних антитіл скомпонентамі клітини коринебактерій дифтерії (неспеціфіческіепреціпітати). Останні можуть формуватися як у токсигенних, втому числі і у контрольного штаму, так і у нетоксігеннихкорінебактерій дифтерії. Іноді відзначається поява множественнихліній преципитации. Неспецифічні преципітати, як правило, слабо виражені, мають нечіткі контури, з`являються частіше через 48 -72 години, в окремих випадках можуть з`являтися і на перші суткі.Крітеріем оцінки специфічності преципітатів є злиття лінійпреціпітаціі випробуваного штаму зі специфічними лініяміконтрольного токсигенного штаму. У тих випадках, коли уконтрольного штаму формується кілька ліній преципітації, специфічними слід вважати більш чіткі і рано появляющіесяпреціпітати. Тому перегляд чашок з пробою на токсігенностьосуществляют через 18 - 24 години від моменту її постановки. Якщо напротязі цього періоду у контрольного штаму лінії преціпітацііне виявляються, це свідчить про порушення условійпостановкі реакціі.Варіанти оцінки результатів реакції: 1. Випробовувані культури коринебактерій дифтерії являютсятоксігеннимі, якщо утворені ними лінії преципітації зливаються або мають тенденцію до злиття з відповідними спеціфіческімілініямі контрольного токсигенного штамма.2. Випробовувані культури коринебактерій дифтерії являютсянетоксігеннимі, якщо: а) лінії преципітації, утворені випробуваної культурою, відсутні, при наявності специфічних ліній преципітації уконтрольного штаму-б) лінії преципітації не можуть злитися зі спеціфіческімілініямі преципитации контрольного штаму, а схрещуються або імеюттенденцію до схрещування з ними (неідентичні , неспеціфіческіелініі) -в) лінії преципітації випробуваної культури зливаються снеспеціфіческімі лініями контрольного штаму-г) лінії преципітації випробуваної культури перехрещуються соспеціфіческімі лініями і зливаються з неспецифічними лініяміконтрольного штамма.Очіщенний ферментолиз і специфічної сорбції антитоксин несодержіт антитіл до компонентів мікробної клітини. При іспользованііетого препарату неспецифічні лінії преципітації НЕ образуются.МЕТОДІКА визначення токсигенності СВОЙСТВКОРІНЕБАКТЕРІЙ ДИФТЕРІЇ З ВИКОРИСТАННЯМ ІНДІКАТОРНИХБУМАЖНИХ ДИСКІВ З АНТІТОКСІНОМНа поверхню чашки Петрі з середовищем для определеніятоксігенності дифтерійних мікробів поміщають індикаторні диски сдіфтерійним антитоксином. Навколо кожного диска з антітоксіномформіруют 5 "бляшок": дві "бляшки" - Контрольного штаму і три -іспитуемие (з одного аналізу з підозрілими колоніяміформіруют мінімум дві "бляшки" з ізольованих колоній і одну -з суміші 3 - 6 однотипних колоній- матеріалом з цього ж аналізаможно зайняти місця навколо іншого диска з антитоксином). всі п`ять"бляшок" розташовують симетрично навколо диска на відстані 0,8 смот його краю. Діаметр кожної "бляшки" 0,8 см. На одній чашці Петріможно розмістити до чотирьох дисків з антитоксином і, відповідно, до 20 "бляшок" з культурами. Чашки з посеваміпомещают в термостат при 37ш C.Результат реакції враховують через 18 - 24 години, а також -через 48 годин. Наявність ліній преципітації між диском сантітоксіном і випробуваної культурою свідчить про еетоксігенності. Досліджувана культура вважається токсичною, еслілінія преципитации даної культури зливається під кутом з лініейпреціпітаціі контрольного штаму. Відсутність ліній преципітації уіспитуемих культур через 48 годин, при наявності їх у контрольнихштаммов, вказує на відсутність токсигенности у ізучаемихкультур. Лінії преципітації у контрольних штамів должнипоявляться через 18 - 24 години. Більш пізня поява лінійпреціпітаціі вимагає перевірки якості поживного середовища ілізамени контрольного штамма.Храненіе контрольного штаму в лабораторііДля зберігання контрольного штаму в лабораторії можноиспользовать напіврідкий сироватковий агар, приготовлений набульоне Мартена або іншому поживному бульйоні (pH 7,6). Зберігати в холодильнику, пересівши один раз в 2 - 3 місяці. Напіврідкий агарразлівают по 8 мл в пробірки і додають по 1 мл сивороткікрупного рогатої скота.Контрольний токсігеннийштаммкорінебактерій дифтерії, варіанти гравіс отримують в Державному НДІ стандартизації іконтроля медичних і біологічних препаратовім.Л.А. Тарасевича. У пробі на токсигенность не можна використовувати, в як контрольного, виробничий штам PW-8 і його варіанти.Контрольний штам необхідно періодично пасерувати на кровяномагаре. Для успішної ідентифікації коринебактерій діфтерііконтрольний токсігенний штам пересівати кожні 1 - 2 суток.МЕТОДІКІ ВИЗНАЧЕННЯ біохімічних ПРІЗНАКОВОПРЕДЕЛЕНІЕ ЦІСТІНАЗНОЙ АКТИВНОСТІ (ПРОБА Пізу) Коринебактерії дифтерії та коринебактерій ульцеранс, в отличиеот ложнодіфтерійной палички Гофмана та інших корінеформнихбактерій, мають ферментом цістіназой.Іспитуемую культуру засівають петлею "уколом" в пітательнуюсреду для визначення цистиназу, розлиту в вузькі пробіркістолбіком висотою 3 см. У складі живильного середовища є цистин уксусно - кислий свинець. У процесі росту культура продуціруетцістіназу, що розщеплює цістін- а утворюється при етомсероводород вступає в реакцію з оцтово - кислим свинцем, которийпревращается в сірчано - кислий свинець - з`єднання темно-коричневий кольори. Коринебактерій дифтерії і корінебактерійульцеранс викликають не тільки почорніння середовища по ходу уколу, але іобразуют навколо нього хмарка темно - коричневого кольору навідстані приблизно 1 см від поверхні середовища. Результат реакцііучітивают через 24 години. При наявності множинного зростання, дляотримання прискореного відповіді (через 3 години), середу інокуліруютбольшім кількістю культури. Одночасно з іспитуемимікультурамі, проводиться посів контрольного штаму в отдельнуюпробірку.ОПРЕДЕЛЕНІЕ уреазна АКТІВНОСТІЛожнодіфтерійние палички Гофмана, коринебактерії ульцеранс ідеякі інші мікроорганізми роду Corynebacterium обладаютспособностью продукувати в процесі росту фермент уреазу ірасщеплять сечовину. Коринебактерії дифтерії такою здатністю необладают.Пробу на уреазу можна ставити в 2-х варіантах - по методуЗаксе (а) і шляхом посіву на бульйон з сечовиною (б) .а) Для визначення уреази за методом Закса extempore смешівают1 частина реактиву А і 19 частин реактиву В. Суміш розливають в узкіепробіркі по 0,1 мл і вносять одну петлю випробуваної чистої культурисо скошеного агару або з пробірки із середовищем Пізу. Для видачіускоренного відповіді, при наявності множинного зростання однотіпнихколоній на чашці первинного посіву, допускається внесеніенесколькіх колоній в одну пробірку з пробою на уреазу. Результатучітивают після інкубації в термостаті при 37ш C протягом 30 мін.б) Чисту культуру коринебактерій дифтерії засівають в бульйон смочевіной, розлитий в пробірки по 2 - 3 мл і поміщають в термостат, результат враховують через 24 години інкубації при 37ш C.Фермент уреаза розщеплює сечовину з утворенням аміаку іуглекіслоти. При цьому підвищується pH середовища і відбувається ізмененіецвета індикатора (почервоніння). При відсутності у ісследуемойкультури цього ферменту, фарбування середовища не проісходіт.Рекомендуется одночасно, в окрему пробірку, засеватьконтрольний штамм.ОПРЕДЕЛЕНІЕ сахаролитической АКТІВНОСТІДля ідентифікації коринебактерій дифтерії використовують такжеоценку сахаролитической активності виділених культур на средахГісса з вуглеводами - сахарозою, глюкозою, розчинним крахмалом.Каждую пробірку з середовищем Гисса інокуліруют 1 петлею чістойкультури. Результат враховують через 24 години, а при отріцательномкрахмальном ознаці - через 48 годин культивування посівів втермостате при 37ш C.Прі сбраживании того чи іншого вуглеводу утворюється кислота, відбувається відновлення знебарвленого фуксину і средапріобретает малинове забарвлення. Рекомендується одночасно ставітьпробу з контрольним штамом коринебактерий дифтерії варіантагравіс.ОПРЕДЕЛЕНІЕ НІТРАТРЕДУКТАЗНОЙ АКТІВНОСТІСпособность коринебактерий дифтерії відновлювати соліазотной кислоти (нітрати) в солі азотної кислоти (нітрити) є додатковою ознакою, що дозволяє діфференціроватькорінебактерій ульцеранс.Проізводят посів досліджуваної культури в пробірку з нітратнимбульоном, інкубують протягом 24 годин при температурі 37ш C.Затем додають 2 - 3 краплі реактиву на нітрити (Грісса іліКасаткіна). У разі якщо відбулося утворення нітритів, средаокрашівается в червоний колір. Якщо мікроорганізми не обладаетнітратредуктазой, зміни забарвлення середовища не проісходіт.Одновременно з досвідченими пробірками, інкубують контрольнуюпробірку зі стерильною средой.5. Живильні средиКачество поживних середовищ має найважливіше значення при любомбактеріологіческом дослідженні. Щоб домогтися максімальнойвисеваемості коринебактерий дифтерії з досліджуваного матеріалу, необхідно створити оптимальні умови для росту, розмноження етіхбактерій, збереження їх біологічних властивостей, а також дляінгібірованія зростання супутньої мікрофлори. Це достігаетсяпутем використання універсальних поживних основ з добавленіемкрові і теллурита калію. Телурит калію, в определеннойконцентраціі, не перешкоджає зростанню представників родакорінебактерій і практично повністю пригнічує ріст постороннеймікрофлори.Кровяниетеллурітовие середовища є такжедіфференціально - діагностичними, оскільки колоніікорінебактерій на цих середовищах мають сіре або чорне забарвлення (дані мікроорганізми здатні відновлювати телурит калію дометалліческого телуру, речовини чорного кольору, і накопичувати еговнутрі клітин) .НПО "живильні середовища", М Махачкала випускає сухуюхінозольную диференційно - діагностичне середовище Бучина длявиделенія коринебактерий дифтерії, яка готується по прописи наетікетке з додаванням 5% крові (не допускається добавленіесивороткі замість крові). Середа Бучина поступається кровянимтеллурітовим середах по інгібуючої активності, а колоніівозбудітеля дифтерії можуть з`являтися на добу пізніше, ніж накровяних телуритовий середовищах. В останні роки ДержНДІ прікладноймікробіологіі (п. Оболенський Московської обл.) Випускає пітательнуюсреду для виділення коринебактерій дифтерії - корінебакагар.Однако, в порівнянні з кров`яними телуритовий середовищами, на даннойсреде виростає в 2 - 3 рази менше колоній корінебактерійдіфтеріі.Учітивая вищевикладене, як і раніше, кращими пітательнимісредамі для первинного посіву матеріалу є кровяниетеллурітовие середовища. В якості основи для цих середовищ можноиспользовать сухий поживний агар (СПА) виробництва НВО"живильні середовища" (М Махачкала), живильний агар на основепанкреатіческого гідролізату рибного борошна (ГРМ) виробництва ГНІІПМ (п. Оболенський). Поживний агар готують за прописом на етикетці іextempore додають кров і телурит калія.Для визначення токсигенних властивостей коринебактерій діфтеріівипускается комерційна суха середу ОТДМ (НУО "Пітательниесреди", М Махачкала) і ГНІІПМ (п. Оболенський Московської обл.). Дані середовища готуються по прописи на етікетке.Лучшей основою при приготуванні середовища для определеніятоксігенності і проби Пізу залишається Мартенівський пептони, которийготовітся в умовах лабораторії або в відділах поживних среднекоторих науково - дослідних інститутів для пріготовленіяМартеновского агара.Для відсіву колоній і культивування коринебактерій дифтерії влабораторних умовах готують сироваткову агарове среду.Прімененіе згорнутої сироватки є нецелесообразним.Каждая нова серія живильного середовища (як комерційної, так іпріготовленной в лабораторних умовах) подлежітбактеріологіческому контролю. У тих випадках, коли ростовиесвойства живильного середовища не задовольняють пред`являемимтребованіям, поживні агарові основи готують на бульйонах -сухий живильний бульйон (СПБ) виробництва НВО "Пітательниесреди" (М Махачкала), ГРМ-бульонпроізводстваГНІІПМ (п. Оболенський) - бульйон на аминопептид для мікробіологічних целейпроізводства м`ясокомбінатів (р.р. С.-Петербург, Армавір, Ставрополь) і бульйонах, приготованих в лабораторних умовах (перевар Хоттингера, 1% пептонна вода, з вмістом амінногоазота 150 - 180 мг /%). Живильні середовища для первинного посіву розливають по чашкамПетрі шаром 3 - 4 мм. Вони можуть бути використані в течение3 доби, за умови зберігання при температурі 4ш C.МЕТОДИ ПРИГОТОВЛЕНИЯ поживних середовищ І РЕАКТІВОВТРАНСПОРТНАЯ середовища (середовище накопичення) В якості основи для приготування транспортної средиіспользуют 0,1% поживний агар на переварити Хоттингера або 0,1% агар на комерційному живильному бульйоні, pH 7,6.0,1% агарове основу розливають в пробірки по 4 мл, стерілізуютв автоклаві при 1 атм протягом 20 хв. Термін зберігання - до1 місяця при 4ш C. Перед вживанням в кожну пробірку, ссоблюденіем правил асептики, додають 0,5 - 1,0 мл сивороткікрупного рогатої худоби і по 0,05 мл (1 крапля) 2% растворателлуріта калію. Середу вибірково контролюють на стерильність, витримуючи при 37ш C протягом 48 годин. Термін зберігання готовойсреди - 10 днів при 4ш C.ЖІДКАЯ ЖИВИЛЬНА середу ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РНГАС метою індикації дифтерійного токсину в РНГА матеріал з чашкіпервічного посіву засівають в пробірку з рідкої сивороточнойпітательной середовищем, приготовленої на основі бульйону Мартена, ссодержаніем амінного азоту 150 - 180 мг /%, pH 7,6. Пітательнийбульон розливають в пробірки по 3,5 мл, стерилізують в автоклаві прі1 атм. протягом 20 хв. Термін зберігання - до 1 міс. при температуре4ш C.Перед вживанням в кожну пробірку з дотриманням правіласептікі додають 0,5 мл сироватки великої рогатої худоби і0,05 мл (1 крапля) 2% розчину теллурита калію. Середу контроліруютна стерильність і зберігають так само, як і напіврідку транспортнуюсреду.СРЕДИ ДЛЯ ПЕРВИННОГО ПОСІВУ ДОСЛІДЖУВАНОГО МАТЕРІАЛАСреда Клауберга IIК 100 мл стерильної живильного агаровой основи (pH 7,6), розплавленого і охолодженого до 50Ш C, додають 10 мл гліцеріновойсмесі, 50 мл "лакової" крові і 3 мл 2% розчину теллурита калія.Прінімая до уваги, що живильне середовище разводітсягліцеріновой сумішшю і "лакової" кров`ю в 1,6 рази, пріпріготовленіі даного середовища слід збільшити навішення сухогопітательного агару, в 1,6 раза.Прімер розрахунку. На етикетці флакона з сухим коммерческімпітательним агаром вказана навішування, необхідна для пріготовленіяодного літра середовища, наприклад 30 м Для приготування 1 літрапітательной основи для середовища Клауберга II слід взяти навеску48 г (тобто 30 г x 1,6 = 48 г) .Для приготування гліцеринової суміші до 40 мл дефібрінірованнойкрові або кров`яної суміші додають 20 мл хімічно чістогостерільного гліцерину (гліцерин стерилізують при температурі 110ш Cв протягом 30 хв.). Для приготування "лакової" крові до 34 мл стерільнойдістіллірованной води додають 16 мл дефибринированной крові.КРОВЯНОЙ телуритовий АГАР (КТА) До 100 мл стерильної живильного агаровой основи (pH 7,6), розплавленого і охолодженого до 50Ш C, додають 7 млдефібрінірованной або 10 мл гемолизированной крові і 2 мл 2% розчину теллурита калію. Замість крові можна використовувати сухуютеллурітовую суміш (11 мл на 100 мл середовища), при цьому, на 100 млКТА додають extempore 1 мл 2% розчину теллурита калію, т.к.1 мл 2% розчину вже міститься в 11 мл кров`яної теллурітовойсмесі. Беручи до уваги, що живильне середовище разводітсякровью приблизно в 1,1 рази, при приготуванні даного середовища следуетувелічіть навішення сухого поживного агару в 1,1 раза.Прімер розрахунку. На етикетці флакона з сухим коммерческімпітательним агаром вказана навішування, необхідна для пріготовленіяодного літра середовища, наприклад, 30 м Для приготування 1 літрапітательной основи для КТА слід взяти наважку 33 г (тобто 30 г x1,1 = 33 г) .МЕТОДІКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ КРОВЯНИХІ кров`яні - телуритовий СМЕСЕЙДля приготування поживних середовищ найкраще іспользоватьдефібрікірованную кров тварин - великої рогатої худоби, коней, свиней, овець, кролів. Кров збирають в стерільниесосуди з намистом за допомогою спеціально змонтованої системи, дотримуючись правил асептики. В окремих випадках кров збирають, немонтіруя спеціальних систем, зливаючи перші порції крові внебутилі.Можно використовувати кров людини з вичерпаним терміном придатності (цитратную і з консервантами), приготувавши з нього спеціальниекровяние суміші. Для цього необхідно видалити рідку частьотстоявшейся крові, що містить цитрат натрію та консерванти. КОСТАЛ в посудині еритроцитарної маси додати стерільнийфізіологіческій розчин, який також можна видалити послеоседанія еритроцитів, і додати дистильованої води допервоначального об`ема.Хорошім сирьемдляполученія кров`яної суміші служітерітроцітарная маса, яка може залишатися при проізводствегаммаглобуліна і інших препаратів крові. До еритроцитарної масседобавляют стерильну дистильовану воду з розрахунку 1/3 об`емаерітроцітарной масси.Можно також використовувати кров`яні згустки, що залишаються послесерологіческіх реакцій (при негативному результаті реакції), згустки плацентарної або абортної крові. Згустки збирають встерільние бутлі зі скляними бусами або битим склом, потім заморожують і розморожують, після чого згустки легко разбіваютсябусамі. Цю процедуру можна повторити 2 - 3 рази. Потім добавляютстерільную дистильовану воду з розрахунку 1/4 об`єму сгустков.В кров`яні суміші, приготовані вищевказаним способом, додають телурит калію в якості консерванту. До кожних 10 млкровяной суміші додають 1 мл 2% розчину теллурита калію. Такуюкровяно - телуритовий суміш можна зберігати при 4ш C до2 месяцев.Прімер розрахунку. Якщо з відстояною цитратной крові об`емом250 мл було видалено 50 - 60 мл рідкої частини, то необходімодобавіть така ж кількість - 50 - 60 мл стерільногофізіологіческого розчину, перемішати, знову дати відстоятися, після чого видалити 50 - 60 мл рідкої частини і внести 50 - 60 млстерільной дистильованої води. Таким чином, буде получено250 мл кров`яної суміші. Для її консервування необхідно добавіть25 мл 2% теллурита калію (на кожні 10 мл кров`яної смесіпрібавляют 1 мл 2% теллурита калію) .В подальшому при приготуванні кров`яної телуритовий средина кожні 100 мл поживного агару додають 11 мл кровянойтеллурітовой суміші (10 мл кров`яної суміші і 1 мл 2% растворателлуріта калію). Extempore в таке середовище додають ще 1 мл 2% розчину теллурита калія.Пріготовленіе розчину теллурита каліяДля телуритовий середовищ використовують готовий коммерческій2% -розчин теллурита калія.Прі відсутності комерційного препарату розчин теллурита каліяготовят наступним чином: в 100 мл дистильованої водирастворяют 2 г кристалічного теллурита калію. Для стерілізацііраствор прогрівають в киплячій водяній бані 30 хв. і зберігають притемпературі 4шC. Кристалічний телурит калію хранятгерметіческі закритим в банку з темного стекла.СИВОРОТОЧНИЙ АГАРСивороточний агар, який використовується для відсіву колоній ікультівірованія коринебактерий дифтерії, може бути приготований намилується з перерахованих вище поживних основ.К 100 мл розплавленого і охолодженого до температури 50Ш Cпітательного агару (pH 7,6) стерильно додають 10 мл сивороткікрупного рогатої худоби. Середовище перемішують, розливають встерільние пробірки по 4 - 5 мл і встановлюють їх у наклонномположеніі для отримання скошеного агару, кожна партія которогопроверяется на стерильність. Кілька пробірок поміщають на добу термостат. У разі проростання середовища бракується вся партія.Пробіркі зі скошеним сироватковим агаром зберігають при 4ш C до2 недель.МАРТЕНОВСКІЙ АГАР З М`ЯСНОЮ ВОДОЙДВОЙНОЙ КОНЦЕНТРАЦІІМартеновскій пептони - 0,5 л, м`ясна вода - 0,5 л, агар -агар - 15 г, оцтово - натрій - 5 г, мальтоза - 3 Г.15 г агару промивають протягом робочого дня в проточнойводопроводной воді, ретельно віджимають і переносять в 1 лмартеновского бульйону (0,5 л мартенівського пептона і 0,5 л мяснойводи). Встановлюють pH 7,8 - 8,0 шляхом подщелачивания бульона20% розчином NaOH з папірця з індикатором крезоловий червоний, яка при цій реакції змінює жовтий колір на рожево -маліновий. Бульйон кип`ятять протягом 10 хв. потім додають 0,5% (5 г на 1 л) уксусно - кислого натрію, 0,3% мальтози (3 г на 1 л), перевіряють pH і, якщо потрібно, знову доводять до 7,8 - 8,0, кип`ятять напротязі 15 хв., дають відстоятися в теплому місці (в апараті Коха термостаті) 2 - 3 години і фільтрують через тканинний або ватно -марлевий фільтр. Розливають у стерильні флакони (70 - 80 мл) прибольшое обсязі роботи або пробірки (10 мл) і стерілізуютоднократно текучим паром протягом 30 мін.Мартеновскій пептонСвіние шлунки, бажано парні, з пружними стінками, великою кількістю слизу і без катаральних явищ очищають отжіра (шлунки , просочені жовчю відкидають), розрізають іізмельчают в м`ясорубці. Отриманий фарш зі шлунків поміщають вбутилі ємністю 3 - 5 літрів і заливають підігрітою до 50Ш C водойіз розрахунку на 1 літр води 300 - 500 г подрібненої маси. Туди жедобавляют 1% хімічно чистої соляної кислоти (уд. Вага 1,19) .Массу добре перемішують і ставлять в термостат: або на 15 -18 годин (або більше) при 37ш C- або, при наявності отдельноготермостата при 42ш C, на 18 годин (або більше). Протягом процессапереваріваніябутиль струшують, спочатку частіше (через 1 -1,5 години), потім рідше. У добре перевареному Пептонна на дні бутилілежіт невеликий шар дрібного темного осадка.Полноту осадження баластних білків можна перевірити путемдобавленія до 5 мл профільтрованого пептона 1 - 2 краплі 10% NaOH, муть не повинна появляться.Действіе ферменту зупиняють нагріванням на водяній бані, поступово доводячи температуру до 80ш C, що встановлюється попоказанію термометра, зануреного в бутель з переваром.Нагреваніе триває протягом 10 хв. Для цієї мети можноиспользовать апарат Коха або автоклав. Бутлі тщательновзбалтивают, закривають ватно - марлевою пробкою з бумажнимколпачком і ставлять в прохолодне сухе приміщення для отстаіваніяпрі температурі не вище 12ш C. Пептон придатний до вживання неранее, ніж через 7 днів, коли щільно осядуть зважені частіци.Необходімо додати 20 мл хлороформу на 1 л пептона дляконсервірованія і закрити бутель гумовою пробкою. У такому відепептон може зберігатися без стерилізації при кімнатній температуре.Мясная водаДля приготування м`ясної води подвійний концентрації желательноіспользовать свіже м`ясо молодої тварини середньої упітанності.Обезжіренное, звільнене від сухожиль м`ясо пропускають черезмясорубку, заливають водою в пропорції 1 л води на 1 кг фаршу іоставляют на ніч при 4ш C, вранці суміш кип`ятять на асбестовойсетке протягом 15 - 20 хв. з моменту закипання. Готовий отварфільтруют, фарш віджимають, отриману м`ясну воду розливають встерільние бутлі по 250 - 500 мл і стерилізують текучим паром3 дні поспіль по 30 хв. Зберігають при 4ш C.Бумажкі з індикатором крезоловий красний0,1 г крезолового червоного розчиняють в 100 мл 95% спирту іоставляют при температурі 37ш C на 24 години, часто струшуючи. На наступний день змочують в цьому розчині смужки фільтровальнойбумагі і швидко висушують. Яскраво - жовтий колір папірців у щелочнойсреде переходить в різні відтінки красного.СРЕДИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ЦІСТІНАЗНОЙ АКТІВНОСТІСреда Пізу на мартенівських агареК 90 мл розплавленого 1,5% мартенівських агару (не допускається використання агару Хоттингера), pH 7,6, добавляют2 мл 1% -розчину L -цістіна в 0.1N розчині соляної кислоти (HCl), ретельно перемішують і додають такий же об`єм 0.1N раствораNaOH для нейтралізації кислоти. Розчини кислот і лугів должнибить взаємно відтитровані, можна іспользоватьфіксанали, що випускаються підприємствами хімічної промишленності.Среду стерилізують при температурі 112ш C протягом 30 хв., Зберігають протягом 1 місяця при 4ш C.Агар з цистином розплавляють при 90ш C (середовище не кип`ятять - длязбереження цистину). До охолодженої до 45ш C середовища додають 1 мл10% розчину оцтовокислого свинцю і 9 мл сироватки крупногорогатого худоби, з дотриманням правил асептики, і розливають попробіркам.Необходімо враховувати, що при температурі середовища 50Ш C і вище, в присутності оцтовокислого свинцю, сироватка мутніє і средапріобретает молочний колір. Це ускладнює облік результатовреакціі.Среда Пізу на основі комерційної середовища АГВДля приготування середовища Пізу можна використовувати доступну ісбалансірованную за складом комерційну середу АГВ, яка застосовується вбактеріологіческой практиці для визначення чувствітельностімікроорганізмов до антибіотиків. Наважку сухого середовища АГВ вкількості 2,7 г вносять в 90 мл дистильованої води і кип`ятять доее повного розчинення. Готують 5% розчин гідрокарбонату натрія.Для цього розчиняють 0,5 г NaHCO в 10 мл дистильованої води.Затем в розчин вносять 0,1 г L-цистину і кип`ятять до полногорастворенія цистину. Потім 2 мл киплячого лужного растворацістіна вносять в 90 мл розплавленої середовища АГВ, доводять pH до7,6 і стерилізують при 112ш C протягом 10 хв. До розплавленої іохлажденной до 45ш C основі послідовно додають: 10 млсивороткі великої рогатої худоби, 1 мл 10% растворауксуснокіслого свинцю, 1,5 мл стерильного свіжоприготованого 10% розчину тіосульфату натрію і розливають по пробіркам.Раствори уксуснокислого свинцю і тіосульфату натрію готовятextempore, використовуючи стерильні пробірки і дистильовану воду, стерилізують текучою парою або на водяній бані протягом 30 мін.Данний варіантсреди Пізу використовують при отсутствііМартеновского агару. Однаконеобходімоучітивать, чтодіфференціально - діагностичні властивості цього середовища в порівнянніз середовищем, приготовленої на мартенівських агарі, менш виражени.СРЕДИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ уреазна АКТІВНОСТІПробу на уреазу можна ставити в 2 варіантах: за методом Закса Іпуть посіву на бульйон з мочевіной.Пріготовленіе реактивів для определеніяуреазной активності за методом ЗаксеГотовят 2 реактиву - А і В.Реактів А: Сечовина 2 Г96% етиловий спирт 2 млДістіллірованная вода 4 млРеактів В: 0,2% -розчин фенолрот 1 млОднозамещенний фосфат калію (KH PO) 0,1 г2 4Двузамещенний фосфат калію (K HPO) 0,1 гХлорід натрію (NaCI) 2 40,5 гДістіллірованная вода100 млРеактів А чи не стерилізують і зберігають при температурі 4ш C.Реактів в стерилізують в автоклаві текучою паром.Бульон з мочевінойК 100 мл стерильного м`ясо - пептонному або бульйону Хоттингера (pH 7,0 ) додають 1 г сечовини і 0,2 мл 1,6% спиртового раствораіндікатора крезолрот. Розливають по 2 - 3 мл в стерильні пробірки стерилізують текучою парою протягом 10 мін.СРЕДА ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ сахаролитической АКТІВНОСТІДля визначення сахаролитической активності рекомендуетсяіспользовать живильне середовище на 1% пептонною воде.К 100 мл гарячої дистильованої води додають 1 г пептона, 0,5 г хімічно чистого NaCI і 1 мл індикатора Андреде.Устанавлівают pH 7,4, кип`ятять 5 хв., фільтрують через паперовий іліполотняний фільтр, доводять до початкового об`єму горячейдістіллірованной водою. До отриманої основи додають один ізуглеводов: сахарозу, глюкозу (в кількості 1 г), крохмаль (0,5 г) .Серед розливають в пробірки по 2 - 3 мл і стерилізують текучімпаром протягом 3 днів по 30 хв. або при 0,5 атм. 30 хв. Готовиесреди з індикатором Андреде безбарвні або мають злегка розоватийоттенок.Індікатор АндредеПосуда для приготування індикатора повинна бути сухою, хімічно чистої, з притертою пробкой.К 100 мл дистильованої води додають 0,5 г кислого фуксінаі 16,4 мл 4-процентного розчину NaOH. Розчин на добу оставляютпрі 37ш C, періодично струшуючи, дві доби витримують насвете і потім прибирають в темне місце. Свіжоприготовлений растворімеет солом`яно - жовтий колір або злегка рожевий відтінок, которийісчезает в процесі зберігання. При інтенсивно - рожевого окраскераствора в процесі приготування індикатора необхідно добавітьеще 1,6 мл 4-процентного розчину NaOH.СРЕДА ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ НІТРАТРЕДУКТАЗНОЙ АКТІВНОСТІК 100 мл поживного бульйону (МПБ або бульйону Хоттингера) pH 7,3 - 7,5, вільному від нітритів (перевірити реактивом Гріссаілі Касаткіна), додають 0,1 г вільного від нітритів нітратакалія (KNO). Перевіряють ще раз на вміст нітритів і розливають по32 мл в хімічно чисті, сухі пробірки. Середовища стерилізують 15 мін.прі 120ш C.Реактів ГріссаРаствор 1: 0,8% сульфаниловая кислота в 5N оцтової кіслоте.Раствор 2: 0,6% диметил-альфа-нафталамін в 5N уксуснойкіслоте.Перед виконанням реакції змішують рівні об`єми розчинів 1 і 2. реактив придатний до застосування протягом 15 хв., безбарвний, пріпоявленіі рожевого забарвлення - непридатний. Розчини 1 і 2 хранятпрі 4ш C протягом 2 мес.Реактів КасаткінаРаствор 1: 0,1% розчин риванолу в дистильованій воде.Раствор 2: 12% розчин соляної кислоти (HCI) .Перед виконанням реакції змішують рівні об`єми розчинів 1 і 2. Реактив придатний до застосування протягом 15 хв. Розчини 1 і 2хранят при 4ш C протягом 2 мес.РЕЦЕПТИ КРАСОК1. Лужний метиленовий синій Леффлера.Дістіллірованная вода 99 мл1% розчин гідроксиду калію (КОН) 1 мл10% спиртовий розчин метиленового синього 30 млСмешать. Фарбувати протягом 1 - 2 мін.2. Уксуснокислий толуїдиновий сіній.Толуідіновий синій 0,5 гЛедяная оцтова кіслота2 мл96% етиловий спирт 5 млДістіллірованная вода 100 млСмешать. Фарбувати протягом 3 - 5 мін.3. Кристалічний фіолетовий.Крісталліческій фіолетовий 0,25 г5% розчин оцтової кислоти 100 млСмешать. Профільтрувати. Фарбувати протягом 5 - 7 мін.МЕТОДИ КОНТРОЛЮ поживних СРЕДБактеріологіческому контролю підлягають середовища для первічногопосеваматеріала і середовища для визначення токсигенних, біохімічних і сахаролитических властивостей. При виготовленні средважним моментом є попередній контроль основи середовища наутримання аминного азота.МЕТОД КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ Амін АЗОТАПрінціп методу заснований на блокуванні формальдегідом при pH7,0 вільних аміногруп і титрування лугом еквівалентногоколічества карбоксильних груп. Початок і кінець тітрованіяопределяют потенціометріческі.Реактіви: 1. Гідроксид натрію (NaOH) 0,1N раствор.2. Соляна кислота (HCI) 0,1N раствор.4. Формалін (40% розчин формальдегіду). Перед каждимопределеніем необхідно довести pH формаліну до 7,0.Ход определеніяДля аналізу використовують певний обсяг рідкого зразка. Дляжідкіх гідролізатів з низьким ступенем розщеплення (0,1 - 0,2% амінного азоту) - 3 мл-із середнім ступенем розщеплення (0,3 -0,6% амінного азоту) - 1 мл-з високим ступенем розщеплення (0,7 -1,3% амінного азоту) - 0,5 мл-для рідких поживних середовищ (0,08 -0,04% амінного азоту) - 3 мл-для рідких екстрактів (0,02 -0,04% амінного азоту) - 10 мл.В стакан ємністю 50 мл вносять досліджуваний зразок і доводятобщій об`єм дистильованою водою до 20 мл. Електродипотенціометра занурюють в досліджуваний розчин і доводять pHраствора до 7,0 за допомогою 0,1N розчину NaOH або 0,1N раствораHCl. Потім додають 2 мл нейтрального формаліну, перемішують і, не виймаючи електродів, титрують вміст проби за допомогою 0,1Nраствора NaOH до pH 9,1. При титруванні слід іспользоватьмікробюретку на 5 мл.Содержаніе амінного азоту в досліджуваному зразку в% (X) обчислюють за формулою: А x До x 1,4 x 100X = ----------------- , гдеB x 1000А - кількість 0,1N розчину NaOH в мл, який пішов на тітрованіеісследуемой проби-к - поправка до титру 0,1N розчину NaOH-1,4 - кількість амінного азоту в мг, еквівалентну 1 мл 0,1Nраствора NaOH-100 - коефіцієнт перерахунку в відсотки-в - кількість рідкого зразка в мл, взяте на аналіз-1000 - коефіцієнт перерахунку мг в г.МЕТОД БАКТЕРІОЛОГІЧНОГО КОНТРОЛЮ поживних Средва практичних лабораторіях кожна партія поживних середовищ, особливо при використанні нових основ (промислового ілілабораторного виготовлення) та нових інгредієнтів , подлежітбактеріологіческому контролю з огляду на можливу їх нестандартності.1. Контроль якості середовищ для первинного посіву ісследуемогоматеріала встановлюють шляхом визначення: а) схожості клітин коринебактерій дифтерії-б) часу формування колоній-в) інгібірующейактівностів щодо сопутствующеймікрофлори.С цією метою використовують контрольний токсігенний штам ілісвежевиделенние токсигенні культури коринебактерій дифтерії стіпічнимі культурально - морфологічними властивостями, штаммзолотістого стафілокока (музейный или свежевыделенный).Суточные культуры коринебактерий дифтерии и стафилококка,выращенные на сывороточном агаре, смывают физиологическимраствором. Мутность полученной суспензии должна соответствовать10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича(условно 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл взвеси). Из исходныхвзвесей культур коринебактерий дифтерии и стафилококка готовятпоследовательные разведения вфизиологическомрастворе(см. схему).СХЕМАПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ КУЛЬТУРЫ КОРИНЕБАКТЕРИЙДИФТЕРИИ И СТАФИЛОКОККА+-----+-----------+---------------------------+------------------+| N | Кол-во | Объем вносимой | Условное кол-во ||про- | физиол. | суспензии, мл | микр. клеток ||бирки| р-ра, мл | | в 1 мл взвеси |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 8 || 1 |1,0| 1,0 из исходной взвеси| 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 7 || 2 |4,5| 0,5 из 1-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 6 || 3 |4,5| 0,5 из 2-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 5 || 4 |4,5| 0,5 из 3-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 4 || 5 |4,5| 0,5 из 4-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 3 || 6 |4,5| 0,5 из 5-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 3 || 7 |2,0| 0,5 из 6-й пробирки | 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+Из двух последн
Поділитися в соц мережах: