Методики

Тестування посуду і пристроїв для збору біологічних рідин (Нечипоренко, 1999)

Альготест для кількісної оцінки біологічної активності хімічних сполук (Барашков, Кірістаева, 1977)

Пробопідготовка для багатоелементного аналізу за методичними вказівками Федерального центру держсанепіднагляду РФ МУК 4.1.1483-03

Пропис методу визначення вмісту свинцю в цільної крові методом ІСП-МС з ізотопним розведенням (Paschal et al., 1995)

Методика багатоелементного аналізу фракцій крові

Визначення сульфаніламідних сполук (метод Пребстінг і Гаврилова в модифікації Тимофєєвої для визначення активності N-ацетилтрансферази) (Першин, 1971)

Тестування посуду і пристроїв для збору біологічних рідин (Нечипоренко, 1999)

Тестування контейнерів (пробірки, флакони), шприців, систем типу «метелик» (пластикових голок і трубок).

1. Розчинник: Суміш 1% HNО₃ і 0,001% Тритона Х-100. Готують на дистильованої воді. 10 мл HNО₃ (Хч) додають до 500 мл води в чистій градуйованій колбі 1 л. Потім додають 1 мл Тритона Х-100. Після розчинення обсяг суміші доводять до 1 л.

2. Для тестування пластикових шприців, контейнерів, капілярних трубок всередину об`єкта вносять 1 мл розчинника і переносять його в аналітичну пробірку. У разі контейнерів розчин витримують всередині перевернутого на кришку або пробку судини протягом 12-14 год. У разі перевірки металевих голок через них пропускають 1 мл розчину. Потім все аналіти окремо досліджують на вміст металів.

3. Всі розрахунки проводять на 1 мл розчину. Загальна сумарний вміст металу у всіх пристроях не повинно перевищувати 5% еквівалента середнього розрахункового рівня вмісту металу в біологічній пробі.

Альготест для кількісної оцінки біологічної активності хімічних сполук (Барашков, Кірістаева, 1977)

На описаний нижче альготест в 1977 р отримано авторське свідоцтво № 557098. Хоча технічно цей метод не дуже складний, потрібно виконати кілька умов, зокрема, забезпечити наявність люміностата (Безперервне освітлення люмінесцентними лампами денного світла з інтенсивністю 3700 ерг / см² сек, температура інкубації 29 ± 3 ° С) і мати досвід роботи з водоростями.

Тестовим організмом служить мезофільні штам зелених водоростей Chlorella pyrenoidosa 82 з колекції каф. мікробіології МДУ. Його вирощують 3 діб при безперервному освітленні лампою розжарювання з інтенсивністю 1 10⁵ ерг / см² сек при 28 ° С в повної середовищі Тамія з сечовиною і доданими мікроелементами в розчині Арнонського-4.

Перед досвідом клітини водоростей (в середині лаг-фази зростання) відокремлюють від середовища центрифугуванням (3 тис.об / хв, 1200g, 5 хв), промивають 0,01% розчином NaCl і розведеної в 5 разів середовищем Успенського-1 з рН близько 7,0, повністю позбавленою органічних добавок.

Оптимальна концентрація клітин водоростей для максимальної чутливості (5 10⁵ - 4 10⁶/ Мл) відповідає 15-40 одиницям "силікою-гелевого показника» (СП), який дорівнює масі суспензії тонкоизмельченного силикагеля КСК в мг / мл з такою ж оптичною щільністю при 578 нм, як і суспензія водоростей.

При оцінці токсичності речовин або їх сумішей можливі варіанти, пов`язані з розчинністю випробовуваних речовин. Водорозчинні речовини вводять в суспензію в концентраціях, що відрізняються на один порядок, наприклад, 10, 1, 0,1, 0,01 мг / мл. Чи не розчинні у воді речовини вводять в сверхрастворітеле, наприклад, диметилсульфоксиде (ДМСО) або диметилформаміді (ДМФА). Концентрація сверхрастворітелей не повинна перевищувати 3% через властивої їм токсичності.

Приготовлені досвідчені і контрольні суспензії з однаковим початковим СП₍₁ розливають по 20-25 мл або в широкогорлі колби Ерленмей-ера (50-100 мл) або в стандартні пробірки в прозорих штативах, закривають ватними пробками і витримують в люміностате 85-95 годину. Технічно зручно і задовільно для статистичної обробки повторити кожен варіант 5-кратно.

Після інкубації колби (або пробірки) поміщають в ванну УЗ-очищувача і опромінюють 10-15 сек ультразвуком потужністю 100 Вт для отримання однорідної суспензії. У них визначають СП досвіду і контролю (СП_До) По оптичної щільності при 578 нм (або число клітин). Розрахунки проводять за формулою:

де Т₂ - Відсоток зміни часу подвоєння культури. Позитивний результат свідчить про затримку росту і наявності токсичного ефекту, негативний - про стимулюючий ефект.

Критичну концентрацію (К_кр) Знаходять графічно. На осі ординат відкладають розрахункові значення% Т₂ (Вище 0 - позитивні, нижче - негативні), а на осі абсцис - концентрацію випробуваного речовини за логарифмічною шкалою. Місце перетину відрізка прямої між точками з більшим і меншим значеннями% Т₂ з 5% рівнем, паралельним осі абсцис, дає величину К_кр- 5% рівень прийнятий як критичний в зв`язку з тим, що ряд речовин не викликають чіткого стимулюючого ефекту, а зниження рівня нижче 5 збільшує відносну помилку визначення.

Дуже зручним виразом результату є, крім К_кр, розрахунок токсичності проби щодо токсичності сульфату міді в «токсо» (Т_з), Виявленої в тій же серії дослідів: Т_з = До^з_кр/ К_кр. Вибір в якості модельного стандарту токсичності CuSO₄ пояснюється тим, що ця речовина задовольняє двом вимогам: 1) воно найбільш широко поширене в якості модельного токсиканта і 2) забезпечує чітку величину К^з_кр при мінімальній різниці між токсичною і стимулюючої концентраціями.

Прімечаніе: З явища виборчої токсичності слід, що універсальних тест-організмів не існує. Відомі тести, наприклад, тест з дафніями, засновані на визначенні LD₅₀, що практично не дозволяє встановити критичну концентрацію випробуваного речовини, тобто таку, вище якої життєдіяльність організму пригнічується. Крім того, тест-організм для дослідів повинен знаходитися в стандартному фізіологічному стані в будь-який час року. Цій вимозі найкраще задовольняють одноклітинні зелені водорості.

Використання мезофильного штаму хлорели дозволяє збільшити чутливість біотеста в порівнянні з будь-яким іншим більш ніж на два порядки, дуже простим способом. Попередньо штам вирощують на повній середовищі з сечовиною, тобто мезотрофний. Потім клітини відмивають від середовища і переміщують в бідні автотрофні умови, тобто піддають подвійному фізіологічного шоку.

Необхідність введення внутрішнього стандарту токсичності випливає з неможливості проводити досліди в різні пори року в однакових умовах. До^з_кр коливається від досвіду до досвіду, але в більшості випадків становить близько 3 мг CuSO₄/ Л.

Пробопідготовка для багатоелементного аналізу за методичними вказівками Федерального центру держсанепіднагляду РФ МУК 4.1.1483-03

Для пробоподготовки за допомогою ІСП-МС слід використовувати посуд із фторопласта, ретельно промиту в УЗ ванні розведеної 1: 1 HNО₃ і тричі прополоскати деионизированной Н₂О.

Відбір, зберігання і підготовка проб

волосся зістригають з потиличної частини голови в кількості gt; 0,1 г, обробляють ацетоном 10-15 хв, 3 рази промивають деионизированной Н₂Про.

нігті зрізають з обох рук і обробляють так само. Обидва об`єкти зберігають в паперових конвертах.

кров з ліктьової вени в кількості gt; 1 мл зберігають в холодильнику 3-5 доби, або в морозильнику (-18 ° С), або ліофілізуют. Для тривалого зберігання зразки поміщають в одноразові поліпропіленові пробірки з герметичними кришками.

Аналогічним чином обробляють кров при отриманні препаратів еритроцитарної маси, плазми і сироватки, а також проби молока, сперми, лімфи, слини.

сечу (Ранкову або добову) в кількості не менше 5 мл поміщають в герметичній пластиковому посуді в холодильник до 3 діб або заморожують.

біоптати м`язів, шкіри, епітелію, печінки і ін. відразу ж після отримання зважують, поміщають в герметичну пластиковий посуд і зберігають у холодильнику 3-5 доби або заморожують.

Проби зубів і кісток поміщають в герметичну упаковку з лабораторного пластику.

препарати амінокислот, полівітамінів, БАВ і сировину для їх виготовлення надходять в упаковці виробника. Мінімальна маса твердих препаратів 10 г, рідких - 100 мл.

Відкрите розкладання проб

Волосся, нігті і ін. Тверді зразки. Наважку проби поміщають у фторопластовий циліндр, додають 0,2-1,0 мл концентрованої HNO₃, накривають захисною лабораторної плівкою і поміщають в термоблок на 0,5-1,0 годину при 115 ° С до повного розчинення. Розчинений зразок кількісно переносять в мірну пробірку і доводять водними змивами до обсягу 10 мл, далі - на аналіз.

Відео: Max OT. методики тренувань

рідкі зразки. Точну наважку зразка (0,1-0,5 мл) поміщають у фторопластовий циліндр, визначаючи масу наважки по різниці маси пробірки до і після отримання навішування. Додають 0,3-1,0 мл концентрованої HNO₃ і гомогенізують пробу, як описано вище.

Для запобігання осадження білків і компенсації високої в`язкості зразків допускається просте розведення проби деионизированной водою з подальшим подкислением з фактором розбавлення не менше 1: 100.

мікрохвильове розкладання

Точну наважку зразка поміщають у фторопластовий вкладиш, додають 5 мл HNO₃ і ставлять в мікрохвильову піч. Розкладання проводять за програмою виробника (зазвичай 5 хв при 200"С), кількісно переносять в пробірку і доводять до об`єму 10 мл водою. Відбирають 1 мл, доводять до об`єму 10 мл 0,5% HNО₃ і аналізують.

Допускається безпосередній відбір аликвотной частини розкладеної проби об`ємом 0,1-0,5 мл. Для компенсації похибки розведення перед розкладанням в пробу вводять внутрішній стандарт (In, Rh), Щоб його концентрація в кінцевому розчині аналіту становила приблизно 10 мкг / л. Розчин внутрішнього стандарту потрібно додавати в усі неодружені і калібрувальні розчини.

Корекція ізобарних накладень, поліатомних накладень і транспортних перешкод

Перешкоди при налагодженні методики виявляють шляхом визначення стандартних добавок і вимірювання серії послідовно розбавлених проб.

корекція ізобарних накладень проводиться автоматично, у відповідність з програмними пакетами приладів для ІСП-МС. Точні коефіцієнти корекції визначають експериментально.

корекція поліатомних накладень вимагає уваги оператора для усунення перешкод. Прилади з реакційної осередком в принципі видаляють більшість поліатомних накладень. Конкретні способи для різних варіантів ручного видалення перешкод відомі і наведені у відповідних інструкціях до наявного приладу.

Транспортні перешкоди коригують шляхом максимально можливого розведення і нормалізації кислотного фону. Застосування внутрішнього стандарту дозволяє усунути похибки розведення зразків і врахувати багато матричні впливу на плазму і потік іонів.

Градуювання приладу, виконання вимірювань, обробка результатів вимірювань і проведення внутрішнього оперативного контролю описані у відповідних інструкціях до приладів. Виробники приладів проводять відповідне навчання операторів в рамках контрактів на поставку приладів.

Пропис методу визначення вмісту свинцю в цільної крові методом ІСП-МС з ізотопним розведенням (Paschal et al., 1995)

Точно зважують дві проби цільної крові по 0,5 м До однієї додають близько 100 мг розчину (близько 100 мкл) зі стандарту SRM 983, що містить 92,15 ат.% ²⁰⁶Рb до кінцевої концентрації близько 1 мг Pb/ Г. В обидві аліквоти додають по 2 мл ультрачистої концентрованої HNO₃ і спалюють їх в мікрохвильовій печі у зважених фторопластових судинах.

Залишки охолоджують, переносять в 15 мл пробірки і розбавляють до 10 мл водою. Аліквоти аналізують за допомогою ІСП-МС і визначають співвідношення ²⁰⁸Рb/²⁰⁶Рb. концентрацію Pb в оригінальній пробі розраховують за формулою:

де [Pb] - Концентрація Pb в невідомої пробі в мкг / г,

К - співвідношення відносної атомної маси натурального Pb до відносної атомної маси Pb в пробі з доданим ²⁰⁶Рb (А_r = 206,063),

c_s - концентрація Pb в пробі з доданим ²⁰⁶Рb в мкг / г,

m_sp - Маса (г) доданого розчину ²⁰⁶Рb,

m_sm - Маса (г) оригінальної проби,

0,0125 - відносний вміст ²⁰⁸Рb в пробі з доданим SRM 983,

0.921497 - відносний вміст ²⁰⁶Рb в тому ж розчині,

208/206 (s) - відношення в доданому розчині,

А₂₀₆ і А₂₀₈ - Природний вміст ²⁰⁶Рb і ²⁰⁸Рb в оригінальній пробі.

Методика багатоелементного аналізу фракцій крові

Для отримання плазми зазвичай в стандартну пластикову пробірку з внесеним антикоагулянтом (гепарин-Na або -Li солі, До₂-ЕДТА = Трилон Б, 9NC цитрат Na, оксалат До) Отримують зразок крові. Клітини необхідно відокремити максимально швидко за допомогою центрифугування, так як дія гепарину недовго, а антикоагулянти значно змінюють елементний склад сироватки. При тривалому зберіганні зразків крові в холодильнику в ній неминуче відбуваються процеси гемолізу, а в морозильнику клітини крові руйнуються.

Для отримання сироватки зразком крові дозволяють коагулировать ( «Згорнутися»), після чого відокремлюють згусток фібрину разом з клітинами. Якщо потрібно отримати безбілковий фільтрат (ББФ), то до 1 частини крові додають 9 частин 5% трихлороцтової кислоти (ТХУ). Білковий осад видаляють центрифугуванням (2 тис. Об / хв, 10 хв). Для визначення елементів використовують супернатант.

0,5 мл крові, або плазми, або сироватки поміщають в посудину мікрохвильовій печі, додають 4,5 мл 30% HNO₃. вміст минерализуется (Наприклад, в мікрохвильовій печі фірми Berghof Speedwave ™ MWS-2 за програмою P₆ в 3-стадійному процесі (25 хв)).

Мінералізований розчин розбавляють 5% HNO₃ до 10 мл (розведення 20-крат) і використовують для визначення в ІСП-МС.

Примітка: У разі зашкалювання результатів по окремих елементах аналіт розбавляють. Всі розведення враховують в остаточному протоколі результатів.

Визначення сульфаніламідних сполук (метод Пребстінг і Гаврилова в модифікації Тимофєєвої для визначення активності N-ацетилтрансферази) (Першин, 1971)

Необхідні реактиви:

1) 15% розчин трихлороцтової кислоти (Тху)

2) 0,5% розчин NaNO₂

3) Насичений розчин CH₃COONa (1 частина солі розчиняють в 2,8 частинах H₂O)

4) 0,5% розчин ацетильованій H-кислоти (1,8-амінооксінафталін-3,6-дисульфокислоти) (приготований в день проведення досвіду)

5) 7-10% розчин НСl

6) Основний стандартний розчин

10 мг сульфадимезина або норсульфазола поміщають в мірну колбу на 100 мл і додають 1-2 мл 0,1 N NaOH до повного розчинення сульфаниламида. доливають дистильовану Н₂O до мітки, тобто до концентрації препарату 100 мкг в 1 мл розчину. Розчин зберігають в холодильнику.

Калібровану криву будують за допомогою серії розчинів взятого для дослідження препарату для аналізу на фотоелектроколориметри (ФЕК) з синім фільтром, наприклад, 10-8-6-4-2 мкг / мл.

Випробуваному дають 1-2 таблетки сульфаніламідного препарату, і збирають добову сечу. В пробірку заливають 0,2 мл сечі, додають 2 мл розчину №1 + 1 мл розчину № 5 і 6,8 мл дистильованої Н₂O. Після перемішування і фільтрування 1 мл фільтрату відповідає 0,02 мл сечі.

Аналіз вільного сульфаниламида. В пробірку заливають 2,5 мл фільтрату сечі, доливають 0,1 мл розчину № 2, перемішують і через 10 хв доливають 1,5 мл розчину № 3 і знову перемішують. Відразу ж додають 0,25 мл розчину № 4. Після ретельного перемішування з`являється рожеве забарвлення. Через 15 хв його інтенсивність вимірюють на ФЕК з синім фільтром.

Робочі стандарти обробляють таті ж. За калібрувальної кривої обчислюють концентрацію вільного препарату з урахуванням всіх розведень.

Аналіз загального сульфаниламида. Після прийому частина препарату в організмі обстежуваного ацетилюється N-ацетилтрансферазою. Цю частину можна визначити тільки після проведення гідролізу. В пробірку заливають 2,5 мл проби і 0,25 мл розчину № 5. Подібним чином працюють також зі стандартними розчинами. Пробірку з сумішшю поміщають в киплячу водяну баню на 30 хв. Після охолодження об`єм рідини в пробірці доводять до 2,5 мл дистильованої Н₂O. Далі працюють з розчином за методикою визначення вільного сульфаниламида.

За калібрувальної кривої, побудованої з розчинами робочого стандарту після гідролізу, обчислюють загальну кількість препарату (вільного та ацетильованого) в даній пробі. Після вирахування кількості вільного препарату отримують кількість ацетильованого препарату в %% по відношенню до загального.

Медична біонеорганіка. Г.К. баранчиків