Критерії якості иммунохимического аналізу гормонів

Будь-який метод повинен бути специфічним, чутливим, точним і мати хорошу відтворюваність результатів. Крім того, методика аналізу повинна бути розроблена так, щоб можна було вимірювати рівні гормонів як у сироватці, так і в цільної крові і в плазмі, а іноді в сечі і слині (якщо мова йде, наприклад, про стероїди). Ще один важливий критерій - мінімальна кількість і максимальна простота операцій, які повинен виконувати персонал лабораторії. Всі ці критерії були розроблені до деталей вже в кінці 1960-х рр., Тому ми зробимо лише кілька зауважень і коментарів.

специфічність

Це найважливіший показник якості будь-якого методу иммунохимического аналізу. Специфічність можна визначити як здатність методу виявляти в пробі тільки певний (аналізований) речовина і не виявлятимуть сторонні речовини, нехай навіть дуже схожі з ним за структурою. Інакше кажучи, специфічність - це здатність методу давати мінімальне число хибнопозитивних результатів. Специфічність иммунохимического аналізу визначається, перш за все, специфічністю первинних антитіл. Вона повинна бути особливо висока при дослідженнях гормонів з ідентичними або схожими антигенними детермінантами. Наприклад, аденогіпофізарной гормони ФСГ, ЛГ, ТТГ і ХГ складаються з двох поліпептидних ланцюгів - аїр, причому а-ланцюга у них ідентичні. Якщо для аналізу будь-якого з цих гормонів, наприклад ФСГ, як первинних антитіл застосовують нізкоспеціфічную поліклональну антисироватки, то велика частина антитіл зв`язується з а-ланцюгами всіх чотирьох гормонів, тому результат вимірювання виявляється хибнопозитивним. Описаний феномен називають перехресної реактивністю. Перехресна реактивність спостерігається і при вимірюванні пролактину, який відноситься до одного сімейства з СТГ і плацентарних лактогенного (у всіх цих гормонів дуже подібні N-кінцеві амінокислотні послідовності).

Специфічність поліклональних первинних антитіл можна підвищити шляхом іммуносорбціі антисироваток на колонках з відповідними антигенами. Цей підхід широко застосовувався до появи гібридомної технології. В даний час в якості первинних антитіл майже завжди використовують високоспецифічні моноклональні антитіла, які зв`язуються з антигенними детермінантами, характерними тільки для даного гормону.

Специфічність иммунохимического аналізу залежить не тільки від властивостей первинних антитіл, але і від безлічі інших, іноді непередбачуваних, чинників. Зокрема, специфічність може знижуватися через перехресної реакції первинних антитіл з якимось невідомим компонентом в аналізованому зразку сироватки або плазми. Бувають випадки, коли в якогось сироваткового білка змінюється конформація і через це він набуває антигенну схожість з аналізованих гормоном. Нарешті, компоненти сироватки можуть впроваджуватися в активні центри первинних антитіл і знижувати специфічність їх зв`язування з антигеном. В технології иммунохимического аналізу існує цілий ряд способів попередження перехресних реакцій, проте все несподіванки передбачити неможливо.

Відео: Жити Здорово! Лікування чоловічого безпліддя

Більшість иммунохимических тест-систем призначене для вимірювання рівнів гормонів в певних біологічних рідинах людини (сироватці, плазмі, сечі, слині). Відповідно, і специфічність тест-систем встановлена для цих біологічних рідин. Якщо ж такі тест-системи використовуються для аналізу гормонів in vitro, наприклад після інкубації ендокринних клітин в буферному розчині Кребса або Рінгера або в будь-якої культуральному середовищі, необхідно особливо перевірити їх специфічність в таких «позаштатних» умовах.

чутливість

Чутливість методу иммунохимического аналізу можна визначити як мінімальну концентрацію речовини, яку можна виміряти даним методом. Для оцінки чутливості використовують стандартний зразок з відомою концентрацією гормону або іншого антигену. З цього зразка шляхом послідовних розведень готують проби з убутними концентраціями гормону. Таким чином, чутливість тест-системи прямо пропорційна ступеню розведення стандартного зразка, при якій вдається отримати точний результат вимірювання. Чутливість імуннохімічної тест-системи залежить насамперед від афінності первинних антитіл, які в ній використовуються. Крім того, чутливість залежить від типу иммунохимического аналізу, на основі якого розроблена тест-система. Як правило, чутливість тест-систем на основі РІА вища, ніж у тест-систем на основі імунохемілюмінесцентного аналізу і ІФА.

Відео: Що таке їжа? 5 Критеріїв. Сироїдіння, фруктоеденіе

Для оцінки чутливості використовують стандартний зразок з відомою концентрацією гормону або іншого антигену. З цього зразка шляхом послідовних розведень готують проби з убутними концентраціями гормону. Таким чином, чутливість тест-системи прямо пропорційна ступеню розведення стандартного зразка, при якій вдається отримати точний результат вимірювання.

Чутливість імуннохімічної тест-системи повинна бути такою, щоб з її допомогою можна було вимірювати рівні гормону, що знаходяться не тільки в діапазоні його нормальних концентрацій, а й нижче цього діапазону. Тому розробники тест-систем прагнуть домогтися чутливості між 3-м і 5-м процентилями норми або в інтервалі між двома і трьома стандартними відхиленнями від нижньої межі норми. Наприклад, діапазон нормальних концентрацій ЛГ у жінок становить 1,1-77 МО / л (2,3 162 пмоль / л). Отже, чутливість тест-системи для вимірювання ЛГ повинна складати приблизно 0,4 МЕ / л (0,84 пмоль / л). Настільки висока чутливість особливо важлива, коли потрібно вимірювати низькі концентрації ЛГ, зокрема при диференціальної діагностики первинної аменореї. У даній ситуації рівні ЛГ менше 10 МО / л вказують на вторинний (гіпогонадотропний) гіпогонадизм, а більш високі рівні - на первинний гіпогонадизм. Імунохімічні тест-системи повинні володіти високою чутливістю і в тих випадках, коли потрібно вловити навіть найменше зміна концентрації гормону. Найчастіше таке завдання постає при плануванні та оцінці ефективності замісної гормональної терапії. Наприклад, при лікуванні гіпотиреозу дозу левотироксину підбирають за результатами вимірювань ТТГ. У нормі рівень ТТГ коливається між 0,4 і 4 мМО / л (2,9-29 пмоль / л). а сучасні тест-системи для вимірювання ТТГ мають чутливість не гірше 0,01 мМО / л (0,073 пмоль / л). Повторні високочутливі вимірювання ТТГ дозволяють ендокринолога дуже точно коригувати дозу левотироксину.

Чутливість тест-системи залежить насамперед від афінності первинних антитіл, які в ній використовуються. Крім того, чутливість залежить від типу иммунохимического аналізу, на основі якого розроблена тест-система (РІА, імунохемілюмінесцентний аналіз, ІФА). Чутливість РІА і імунохемілюмінесцентного аналізу зазвичай вища, ніж чутливість ІФА, оскільки в перших двох методах иммунохимические реакції протікають в рідкій фазі, за рахунок чого антигенні детермінанти гормонів стають більш доступні для первинних антитіл. Однак для науково-дослідних цілей виробляються і високочутливі тест-системи на основі ІФА.

точність

Це ступінь близькості результату вимірювання концентрації гормону до її істинного значення. Точність залежить від чутливості і систематичної похибки методу: чим більше чутливість і чим менше похибка, тим вище точність. Точність иммунохимических тест-систем оцінюють за результатами вимірювань концентрацій гормонів в стандартних зразках.

відтворюваність

Це здатність методу иммунохимического аналізу давати максимально близькі результати при багаторазових вимірах концентрації гормону в одній і тій же пробі в різних умовах (в різний час, в різних лабораторіях). Для оцінки відтворюваності використовують як стандартні зразки, так і проби, отримані від хворих. Щоб домогтися високої відтворюваності, лабораторія повинна досконало володіти методикою роботи з даної тест-системою і проводити вимірювання в стандартних умовах (при одній і тій же температурі, одних і тих же длительностях проведення реакцій).

Відео: Awareness Technology - Робота з автоматичним біохімічним аналізатором ChemWell-T

Специфічність, чутливість і відтворюваність в обов`язковому порядку зазначаються в інструкціях і паспортах до всіх наявних у продажу імунохімічний тест-системам і імунохімічний автоаналізаторе. Проте кожна лабораторія повинна самостійно оцінити всі ці параметри, особливо відтворюваність, в реальних робочих умовах.