Антиген фактора Віллебранда: метод визначення

В основі більшості наборів реагентів для визначення концентрації антигену фактора Віллебранда лежить принцип твердофазного імуноферментного аналізу.

На поверхні пластикової лунки планшета сорбованих антитіла до фактору Віллебранда. На першій стадії дослідження в лунку мікропланшетів додають зразки БТП. Молекули фактора Віллебранда закріплюються на відповідних антитіл і залишаються пов`язаними при промиванні. На другому етапі аналізу в лунку вносять поліклональні антитіла. На наступній стадії дослідження в лунку додають розчин хромогену. Ця речовина забарвлюється після його розщеплення ферментом. Виразність фарбування залежить від вмісту фактора Віллебранда.

Імунологічний метод визначення фактора Віллебранда також може бути реалізований за допомогою ракетного електрофорезу.

Коефіцієнт варіації ELISA для визначення vWF: Ag не перевищує 10%.

Відео: Визначення група крові і резус фактор

Реактиви та обладнання

Буфер промивний, концентрат (рН 7,3).
Буфер для інкубації (PBS- рН 7,3).
Ліофілізовані стандарти.
Ліофілізовані контрольні зразки низького і високого рівнів.
Кон`югат поліклональних антитіл.
Розчин субстрату.
Стоп-розчин.

Відео: Кров (Групи крові, антигени, резус-фактор) [Все просто]

Дистриб`ютор діагностичного набору реагентів - ЗАТ «Біохіммак».

Зразки крові для дослідження

Для виконання фактора Віллебранда тесту використовують БТП.

техніка виконання

Побудова калібрувальної кривої. Далі необхідно побудувати калібрувальну криву, використовуючи лінійну систему координат. Для побудови калібрувальної кривої використовують значення оптичної щільності, отримані при розведенні зразка з відомою концентрацією фактора Віллебранда. На вісь х наносять значення концентрації vWF: Ag в Од / мл або відсотках (1 Од / мл = 100%), а на осі у вказують поглинання. У тих випадках, коли є зразки, значення абсорбції яких вище, ніж значення найвищої точки калібрування, вони повинні бути додатково розведені буфером для інкубації (1 + 1) і повторно досліджені. При цьому отримана в результаті вимірювання концентрація повинна бути помножена на коефіцієнт розведення.

Оцінка результатів дослідження

Концентрація vWF: Ag у здорових людей коливається в широкому діапазоні. Нормативи залежать від варіанту діагностичного набору, обладнання, групи крові, реактивів та багато іншого, тому немає загальноприйнятих діапазонів нормальних значень при вимірюванні цього показника. Діапазон норми, як правило, зазначений в інструкції виробника набору реагентів для визначення фактора Віллебранда, однак багато виробників рекомендують кожній лабораторії встановити свій власний діапазон нормальних значень. Важливо пам`ятати, що середні значення рівня цього протеїну при I групі крові приблизно на 10% нижче, ніж у інших пацієнтів, що завжди слід враховувати при діагностиці цього геморагічного захворювання.

причини помилок

Відсутність або неефективність системи внутрішнього контролю якості. В даний час доступні зразки контрольних матеріалів з атестованими значеннями фактора Віллебранда. З огляду на наявність принципово різних методичних підходів для визначення цього протеїну, необхідно ретельно перевіряти варіант дослідження, для якого був атестований контрольний зразок.
Неправильне дозування цитрату при заборі венозної крові. Недолік натрію цитрату внаслідок низького гематокриту і гемоліз ведуть до погрішностей і невідтворюваних результатів.
Гемоліз.
Підвищення фактора Віллебранда спостерігається в стресових ситуаціях, під час фізичних вправ, при вагітності, кровотечах, артеріальної гіпертензії, інфекційних захворюваннях, терапії естрогенами. У жінок в різні дні менструального циклу можливі коливання концентрації фактора Віллебранда. Для стандартизації гормонального впливу на зміст цього мультімерной протеїну деякі експерти рекомендують діагностувати хворобу Віллебранда у жінок між 5-м і 7-м днями менструального циклу.

Інші аналітичні технології

На жаль, не існує єдиної методики, здатної врахувати всі численні варіанти аномалій цього протеїну, тому для діагностики хвороби Віллебранда розроблений цілий комплекс лабораторних тестів. Базові методи дослідження, які використовуються для виявлення дефіциту або якісної аномалії фактора Віллебранда, засновані на застосуванні імуноферментних технологій. Крім того, для діагностики цього захворювання ефективно вивчення агрегаційної функції оброблених нормальних тромбоцитів з рістоцетін при додаванні досліджуваної БТП. З метою диференціації якісних порушень молекули цього протеїну додатково застосовують і інші методичні підходи.

Визначення ристоцетин-кофакторной активності фактора Віллебранда

Оброблені формаліном тромбоцити втрачають здатність виконувати багато свої функції, в т. Ч. І функцію освіти агрегатів у відповідь на додавання більшості відомих індукторів агрегаційної функції, однак при додаванні рістоцетін в суміш таких тромбоцитів і досліджуваної плазми вони швидко агглютинируют. У такий тест-системі вираженість аглютинації прямо залежить від наявності фактора Віллебранда, тому при зниженні концентрації цього протеїну або його якісної неповноцінності подібна аглютинація слабко виражена або відсутня зовсім. Існує два засадничо подібних методичних варіанту для визначення ристоцетин-кофакторной активності фактора Віллебранда. Перший - кількісний, для його здійснення необхідний агрегометра, другий - Напівкількісний, він передбачає візуальну оцінку часу появи агглютінати в суміші розведеною досліджуваної плазми, рістоцетін і оброблених формаліном тромбоцитів. Обидва методи мають коефіцієнт варіації не більше 10%.

Діагностичні методи, необхідні для диференціації різних варіантів хвороби Віллебранда

Визначення колаген-зв`язуючої активності фактора Віллебранда. Адгезія тромбоцитів до колагенових волокнах з субендотелія реалізується через рецептор тромбоцитів GP-Ib / V / IX. Ця взаємодія вимагає фактора Віллебранда в якості кофактора, тому при аномаліях цього мультімерной протеїну або його недостатній кількості порушується здатність тромбоцитарних рецепторів зв`язуватися з колагеном. Для визначення колаген-зв`язуючої активності необхідний набір реагентів і обладнання для виконання ELISA. Його коефіцієнт варіації не перевищує 15%.

Визначення мультімерной фактора Віллебранда. Сучасна диференціальна діагностика більшості варіантів 2-го типу хворобі Віллебранда заснована також на дослідженні мультімерной фактора Віллебранда. Для оцінки здатності цього протеїну формувати мультімери частіше використовують імунний електрофорез. Процедура визначення мультімерной досить складна, вимагає наявності обладнання для проведення імунного електрофорезу, придатна для виконання в спеціалізованих лабораторіях, повсякденно виконують імунну електрофорез, діагностичних наборів для її здійснення немає. Інформації про специфічність і чутливість цього діагностичного методу в сучасній літературі не представлено, проте зустрічаються повідомлення про раніше невідомі варіантах мультімерной цього протеїну, які деякі фахівці розцінюють як діагностичні артефакти.

Визначення агрегації тромбоцитів з рістоцетін (R1PA). Порушення агрегації тромбоцитів, індукованої рістоцетін, є частим лабораторним проявом хвороби Віллебранда. Цей варіант високоспеціфічен для виявлення субтипу 2В хворобі Віллебранда, при якому спостерігається аномально висока агрегація у відповідь на додавання низьких концентрацій рістоцетін. При інших аномаліях цей метод має лише допоміжне значення, оскільки в звичайному дозуванні він може бути порушений при різних варіантах цієї патології. Для здійснення даної методики необхідні агрегометра і ристоцетин. Відтворюваність дослідження агрегації з рістоцетін залежить в значній мірі від моделі агрегометра, досвіду і професійної підготовки персоналу.