Фактор лейдена

Як було сказано вище, аномалія гена коагуляційного фактора V тисячі шістсот дев`яносто одна Ggt; A була виявлена в 1994 р R. Bertina et al. Однонуклеотидний заміна гуаніну на аденін в положенні 1691 (1691 Ggt; A) в екзоні 10 гена F5 обумовлює молекулярний дефект коагуляционного фактора V. Внаслідок заміни в положенні 506 молекули проакцелеріна аргініну на глутамин (Arg506Gln) порушується його здатність руйнуватися, в результаті чого формуються дисфункція антикоагулянтной системи протеїну С і схильність до рецидивів тромбозів. Генетична аномалія коагуляционного фактора V (Лейден) є найбільш частим тромбофіліческіе дефектом у європейського населення.

Для виявлення цієї генетичної аномалії використовують варіанти ПЛР. Високі чутливість і специфічність ПЛР забезпечують синтезовані in vitro олігонуклеотиди, комплементарні відповідної ділянки гена коагуляційного фактора V людини.

Відсутність єдиної номенклатури генетичних дефектів зумовило поширення в сучасній науковій літературі численних позначень цієї аномалії: F5: одна тисяча шістсот дев`яносто одна Ggt; A, Rs6025, Arg506Gln, G1691A, R506Q, Лейден (лейденовская) і ін.

принцип методу

Для ідентифікації поліморфних алелей в гені F5 використовують амплификацию відповідних ділянок гена методом ПЛР з подальшим визначенням продуктів ампліфікації.

Реактиви та обладнання

• Контрольні зразки з аллелем дикого типу і аллелем мутантного типу.
• Для визначення аномалії F5 1 691 Ggt; A застосовують два праймера. Праймер 1 (forward primer): ACGTTGGATGC TGAAAGGTTACTTCAAGGAC, праймер 2 (reverse primer): ACGTTGGATGCTCTGGGCTAATAGGACTAC.
• Ампліфікатор та інше обладнання для проведення ПЛР.

Зразки крові для дослідження Матеріалом для досліджень може бути будь-яке джерело ДНК, проте частіше використовують венозну кров, яку забирають в пробірки, що містять ЕДТА. Зразки зберігають до проведення дослідження при температурі +2 ... + 8 ° С не більше 24 год. Тривало зберігати зразки можна тільки в замороженому стані при температурі -40 ... 70 ° С.

Виділення ДНК із зразків клінічного матеріалу може проводитися різними методами, наприклад за допомогою наборів на основі силіки, наборів з мікроцентріфужнимі колонками, наборів на основі фенол-хлороформно екстракції та ін.

Методика визначення

Метод заснований на багаторазовому виборчому копіюванні ділянки ДНК за допомогою ферментів in vitro. Хід дослідження повинен відповідати обраному обладнанню та процедурі ПЛР-аналізу (гель-електрофорез, flash або ін.).

Відео: Нідерланди, Північна Голландія. Частина 1. 06-2011

Оцінка результатів дослідження

Оцінка результатів проводиться способами, що дозволяють опеределяется олігонуклеотидних поліморфні заміни. Приклад візуалізації результатів ампліфікації представлений на рис. 5.1.

Відео: всі міста і країни світу в одному місці

Варіанти результатів виявлення лейденовской аномалії гена коагуляційного фактора V наступні: G / A - гетерозиготна форма аномалії в положенні 1691- А / А - гомозиготний варіант аномалії. У популяції переважає генотип G / G.

Інтерпретація результатів дослідження

У носіїв лейденовской аномалії гена F5 є схильність до тромбозів, ризик яких істотно збільшується при вагітності, застосуванні контрацептивів, в післяопераційний період і ін. Пенетрантность гена неповна, тому ряд носіїв не мають в анамнезі тромботичних порушень. При наявності гомозиготного варіанти цієї мутації частота і тяжкість тромбозів вище. Частота виявлення гетерозиготною аномалії, за даними літератури, становить приблизно 1-3% в популяції.

Амінокислотна заміна в положенні 506 порушує сайт розщеплення молекули коагуляционного фактора V активованим протеїном С, що істотно знижує швидкість його деградації. Тому при наявності аномалії гена F5 тисячі шістсот дев`яносто одна Ggt; A спостерігається резистентність коагуляционного фактора Va до активованого протеїну С.

Виявлення цієї мутації у пацієнтів з рецидивами тромбозів дозволяє обгрунтувати пролонговану антикоагулянтную профілактику. Таке дослідження може надати допомогу у виявленні осіб, у яких потрібно вирішити питання про використання антикоагулянтів при здійсненні хірургічних втручань.

Відео: Др. Олена Березовська - Тромбофілії і вагітність

причини помилок

• Помилки преаналітичного етапу дослідження (при порушенні термінів зберігання або неправильного транспортування біоматеріалу нуклеїнові кислоти можуть руйнуватися, що стає причиною хибно-негативних результатів-гепарин здатний пригнічувати ПЛР, тому забір крові не повинен проводитися в пробірки, що містять гепарин).
• Забруднення досліджуваних зразків стороннім біологічним матеріалом.
• Порушення принципів зонування лабораторії для молекулярно-генетичних досліджень.
• Відмова від дослідження негативного контролю.
• Відмова від проведення повторного аналізу позитивних проб.
• Недотримання технології виділення ДНК.
• Специфічність і чутливість ПЛР залежать істотно від структури праймерів, тому використання праймерів різних виробників може обумовлювати отримання відмінних результатів.

Інші аналітичні технології

Варіанти ПЛР визнані надійними лабораторними процедурами, здатними забезпечити високу чутливість, специфічність і відтворюваність. У переважній кількості випадків для діагностики тромбофіліческіе стану, пов`язаного з порушенням інактивації проакцелеріна, можна використовувати коагуляційний метод шляхом визначення резистентності до активованого протеїну С. Однак слід враховувати, що і інші порушення (гіперпродукція антигемофильного глобуліну, ВА і ін.) Також здатні викликати резистентність коагуляционного фактора V до активованого протеїну С.