Непряма діагностика генних хвороб. Точність молекулярної діагностики можливі джерела помилок.

Непрямий (непрямий) підхід до молекулярної діагностики історично є більш раннім і більш універсальним. Він заснований на аналізі внутрішньо-і внегенних поліморфних сайтів. В якості останніх зазвичай виступають короткі ДНК-послідовності одних і тих же гомологічних ділянок хромосом, що розрізняються по первинній структурі. Ці діагностичні поліморфні сайти можуть розташовуватися або всередині самого гена, або в безпосередній близькості від нього.

Неодмінною умовою непрямої ДНК-діагностики є наявність в сім`ї хворої дитини або можливість дослідження його ДНК (плям крові, гістологічних препаратів і ін.). Встановлення інформативності передбачає виявлення такого поліморфного сайту, який може бути використаний в якості молекулярного маркера для дискримінації як мутантного, так і нормального алеля. При цьому в разі аутосомно-рецесивних захворювань батьки будуть гетерозиготами з даного поліморфізму, а хворий - гомозиготой по одному з маркерних алелів. Саме гетерозиготность по молекулярним поліморфізму визначає інформативність тій чи іншій сім`ї високого ризику народження дитини з генної патологією. Залежно від розподілу маркерних алелів на гомологічних хромосомах хворого і його батьків сім`я може бути повністю інформативною для ДНК-діагностики, частково інформативною або неінформативної.

Принципово важливо проаналізувати в родині високого ризику таку кількість поліморфних сайтів одного гена, щоб точно визначити, з яким конкретним аллелем успадковується мутантний ген, і створити сім`ю повністю інформативною для подальшої ПД.

головне перевага непрямого методу - можливість ДНК-діагностики без точної ідентифікації мутацій в самому гені і навіть при відсутності даних про точну ідентифікації і клонування самого мутантного гена. Його істотними недоліками є неможливість діагностики при відсутності хворої дитини (не можна точно визначити, з яким поліморфним аллелем зчеплений мутантний ген), помилка в діагнозі в зв`язку з можливістю кросинговеру в мейозі і перенесення поліморфного сайту на здоровий аллель.

Точність молекулярної діагностики, можливі джерела помилок

При проведенні пренатальної діагностики молекулярними методами важливо пам`ятати про два основні джерела помилок:
- контамінації плодового зразка материнськими клітинами;
- можливості кросинговеру при використанні непрямого методу.

З огляду на дуже високу чутливість методу ПЛР, важливо уникнути забруднення зразків плодових тканин материнськими клітинами. Чистота зразка для аналізу може бьп досягнута тільки шляхом ретельного відбору ворсинок хоріона або плаценти під бінокулярної лупою з подальшим відмиванням фізіологічним розчином. Особливо важливо не допустити потрапляння материнської крові в разі забору пуповинної крові плода при кордоцентез. Висока кваліфікація лікаря-оператора і використання якісних реакцій на виявлення домішки материнської крові дозволяють уникнути цього ускладнення. Ризик подібних діагностичних помилок може бьп значно умен`шен при роботі в стерильних умовах.

Достовірність молекулярної діагностики прямим методом, тобто шляхом ідентифікації мутацій в самому гені, дуже висока і наближається до абсолютної. Однак з урахуванням всього різноманіття можливих змін в геномі при дозріванні гамет (кросинговер) і на початкових стадіях ембріогенезу (мутагенний ефект) більш точним є показник діагностики близько 99,9%. Значно складніше оцінити результати молекулярної діагностики непрямим методом. У разі обліку внутрігенних поліморфізмів точність непрямий діагностики досить висока, так як величина внутрітенного кросинговеру, як правило, не перевищує 0,1% для більшості відомих генів.

Виняток можуть становити лише порівняно великі гени, такі як ген дистрофина, гемофілії А, нейрофіброматозу і деякі інші. Так, в разі дистрофина частота помилкового діагнозу може досягати 2%, що відповідає високій частоті внутрітенного кросинговеру (близько 2%) в цьому гігантському гені (2,2 млн п.о.). Важливо також враховувати ступінь спорідненості хворого і пробанда, у якого проводиться ПД. Величина можливої помилки зростає, якщо маркерний аллель визначається не у сібса плода, а у інших його родичів. Особливо обережно слід оцінювати результати непрямий діагностики з використанням внегенних поліморфних локусів. Вважається, що з упевненістю проводити ПД в цих випадках можна тільки при одночасному тестуванні декількох поліморфних сайтів, що фланкують мутантний ген. Зазвичай для молекулярної діагностики використовують маркери, частота рекомбінації яких з мутантними алелями гена не перевищує десятих або сотих часток відсотка. Характеристика ДНК-поліморфізмів, послідовності праймерів для ПЛР, величини похибки непрямих методів для різних захворювань, діагностованих пренатально, наведені в монографії та оглядах.