Аномалія гена протромбіну 20210 g / a

У сім`ях пацієнтів з тромбозами виявляється аутосомно-домінантне успадкування F2: 20210 G / A.

В даний час встановлено зв`язок цієї генетичної аномалії з гіперпродукцією протромбіну. Однак, незважаючи на наявність технічної можливості визначити підвищений рівень протромбіну, виявлення цієї патології повинно бути засноване виключно на даних ПЛР Високі чутливість і специфічність ПЛР забезпечують синтезовані in vitro олігонуклеотиди, комплементарні відповідної ділянки гена протромбіну людини.

принцип методу

Для ідентифікації поліморфних алелей в гені F2 використовують амплификацию відповідних ділянок гена методом ПЛР з подальшою детекцією продуктів ампліфікації.

Реактиви та обладнання

• Для визначення аномалії F2: 20210 G / A застосовують такі праймерипраймер 1 (forward primer) - 5`-TGGGAAATATGGCTTCTACA-3 `(нуклеотиди 20035-20054) - праймер 2 (reverse primer) - 5`-CACTGGGAGCATTGAAGCT-3` (нуклеотиди 20229- 20211).
• Контрольні зразки з аллелем дикого типу і аллелем мутантного типу.
• Ампліфікатор та інше обладнання для виконання ПЛР.

Зразки крові для дослідження Матеріалом для досліджень може бути будь-яке джерело ДНК, проте частіше використовують венозну кров, яку забирають в пробірки, що містять ЕДТА Зразки зберігають до проведення дослідження при температурі +2 ... + 8 ° С не більше 24 год. Тривало зберігати зразки можна в замороженому стані при -40 ..- 70 ° С.

Виділення ДНК із зразків клінічного матеріалу може проводитися різними методами, наприклад за допомогою наборів на основі силіки, наборів з мікроцентріфужнимі колонками, наборів на основі фенол-хлороформно екстракції та ін.

техніка виконання

Метод заснований на багаторазовому виборчому копіюванні ділянки ДНК за допомогою ферментів in vitro. Хід дослідження повинен відповідати обраному обладнанню та процедурі ПЛР-аналізу (гель-електрофорез, flash або ін.).

Оцінка результатів дослідження

Оцінка результатів проводиться способами, що дозволяють візуалізувати олігонуклеотидних поліморфні заміни. Фрагменти ДНК визначають за допомогою різних флюоресцентних барвників, специфічно зв`язуються з ДНК.

Інтерпретація результатів дослідження

Для багатьох носіїв цього поліморфізму характерні тромбози різної локалізації, ризик яких істотно збільшується при наявності вагітності, застосуванні контрацептивів, в післяопераційний період і ін. Пенетрантность гена неповна, в зв`язку з цим деякі носії не мають в анамнезі тромботичних порушень. При наявності гомозиготного варіанти цього поліморфізму вік першого епізоду менше, а частота, і тяжкість тромбозів вище. Частота виявлення гетерозиготною аномалії, за даними літератури, становить близько 1-2% в популяції. При наявності F2: 20210 G / A рівень протромбіну у пацієнтів приблизно в 1,5-2 рази вище норми.

Виявлення зазначеної аномалії гена протромбіну у пацієнтів з рецидивами тромбозів дозволяє обгрунтувати пролонговану антикоагулянтную профілактику. Таке дослідження надає допомогу у виявленні вагітних з підвищеним ризиком тромбозу.

причини помилок

• Помилки преаналітичного етапу дослідження (при порушенні термінів зберігання або неправильного транспортування біоматеріалу нуклеїнові кислоти можуть руйнуватися, що стає причиною хибно-негативних результатів-гепарин здатний пригнічувати реакцію ПЛР, тому забір крові не повинен проводитися в пробірки, що містять цей антикоагулянт).
• Забруднення досліджуваних зразків стороннім біологічним матеріалом.
• Порушення принципів зонування лабораторії для молекулярно-генетичних досліджень.
• Відмова від дослідження негативного контролю.
• Відмова від проведення повторного аналізу позитивних проб.
• Недотримання технології виділення ДНК.
• Специфічність і чутливість ПЛР істотно залежать від структури праймерів, тому використання праймерів різних виробників може стати причиною розрізняються результатів.

Інші аналітичні технології Різні варіанти ПЛР вважаються надійними лабораторними процедурами, здатними забезпечити високу чутливість, специфічність і відтворюваність. Незважаючи на наявність технічної можливості визначити підвищений рівень протромбіну, діагностика цієї тромбофилии повинна бути заснована виключно на застосуванні варіантів ПЛР.