Тест генерації тромбіну

Цей методичний підхід був запропонований британськими дослідниками в 1953 р для оцінки стану системи гемостазу при гемофілії. Слід, однак, відзначити, що запропонована методика в оригіналі була вельми далека від досконалості, тому тривалий час їй не приділялося серйозної уваги. Друге народження метод пережив завдяки Конраду Хемкеру, яка внесла численні удосконалення в процедуру аналізу в 90-і роки минулого століття. Найважливішою модифікацією К. Хемкера і співавт. стало використання флюоро- і хромогенного субстратів для детекції генерації тромбіну, що істотно підвищило відтворюваність методу. У сучасному варіанті методу тромбін, що утворюється в ході реакції, руйнує пептидний субстрат, що обумовлює вивільнення молекули флюорофора. Зміна інтенсивності світіння реєструється флюоріметре через рівні проміжки часу.

принцип методу

В основі тесту лежить облік швидкості гідролізу пептидного зв`язку флюорогенного субстрату, специфічного до тромбину. Визначення швидкості руйнування субстрату здійснюється флюоріметре в лунках 96-ямкового планшета, в яких інкубують суміш зразка БТП з активатором коагуляції. В якості активатора використовують реагент рекомбінантного тканинного фактора і кальцію хлорид, а для стандартизації і підвищення швидкості коагуляції в тест-систему додають фосфоліпіди. Вивчення кінетики утворення тромбіну дозволяє оцінити баланс прокоагулянтних і антикоагулянтних механізмів.

Реактиви та обладнання

• Рекомбінантний людський тканинної фактор (1 пмоль).
• Специфічний до тромбину флюорогенний субстрат.
• Буферний розчин, що містить кальцію хлорид.
• Калібратор з активністю людського тромбіну 580 нмоль.
• Флюоріметре.

Зразки крові для дослідження

Як зразок для запису тромбоеластограмми слід використовувати БТП. У ряді досліджень для обліку вкладу тромбоцитів в генерацію тромбіну пропонують використовувати багату тромбоцитами плазму. Тест дуже чутливий до дефектів і особливостям преаналітичного етапу дослідження.

Відео: lecture 29 - Test Generation Methods

техніка виконання

Процедура дослідження проводиться відповідно до інструкції до використовуваному устаткуванню і алгоритмом комп`ютерної програми, що обчислює основні показники динаміки генерації тромбіну.

Оцінка результатів дослідження

Флюорогенний субстрат специфічний до тромбину, тому зміна інтенсивності світіння після додавання активатора коагуляції пропорційно швидкості генерації цього ключового коагулюючого ферменту.

Після виконання калібрування стандартною кількістю тромбіну флюоріметре дозволяє побудувати криву генерації тромбіну. У процесі дослідження оцінюють час затримки утворення тромбіну (Lag time), максимальна кількість тромбіну (Peak thrombin), час досягнення максимального утворення тромбіну (ttPeak), а також ендогенний тромбиновой потенціал (ЕТР).

Інтерпретація результатів дослідження

Оскільки коагуляційний фактор На служить ключовим ферментом коагуляционного гемостазу, тест генерації тромбіну представляється цінним інтегральним показником стану системи згортання крові.

Результати тесту залежать від способу активації коагуляції, концентрації активатора і багатьох інших факторів, тому зміна умов методики дозволяє адаптувати її для виявлення різних дефектів системи гемостазу. Так, додавання в тест-систему тромбомодулина допомагає визначити гіперкоагуляційні зрушення на тлі лейденовской мутації. Вивчення генерації тромбіну в багатій тромбоцитами плазмі дає можливість виявити дисфункцію тромбоцитарного гемостазу при тромбастенії Гланцмана, синдромі Бернара-Сульє та ін.

Найбільш часто використовують активацію згортання БТП тканинним фактором, що дозволяє оцінити стан коагуляційного гемостазу. У такому виконанні у хворих на гемофілію та іншими коагулопатіями показник Lag time подовжений, а ЕТР і Peak thrombin знижені. Виразність зазначених змін у таких хворих залежить від активності коагуляційних факторів VIII і IX.

причини помилок

Помилки преаналітичного етапу дослідження, в т. Ч. Неправильна дозування цитрату при заборі венозної крові.

• Дефекти центрифугування при отриманні зразків БТП.
• Попадання в досліджувану кров гепарину з венозного катетера.
• Гемоліз.

Інші аналітичні технології

В даний час розроблені інші аналітичні технології, здатні візуалізувати коагуляційний процес, наприклад метод реєстрації просторового зростання згустку крові, а також тромбоеластографія. Всі подібні методики візуалізують згортання крові і здатні обчислити інтегральні показники коагуляції, але їх діагностична специфічність поки залишається низькою.