Комбінована діагностика генних хвороб. Біохімічні методи в пренатальної діагностики.

У ряді випадків (відсутність або часткова інформативність) ДНК-діагностика деяких захворювань може бути доповнена іншими діагностичними дослідженнями. У разі гемофілії А можливо пряме визначення рівня фактора VIII згортання крові в пуповинної крові плоду після 20 тижнів вагітності. ДНК-діагностика адреногенитального синдрому може бьп доповнена прямим дослідженням вмісту 17-ОН прогестерону в амніотичної рідини (АЖ). ПД синдрому ламкою Х-хромосоми нерідко доповнюють прямим цитогенетичним аналізом культури лімфоцитів пуповинної крові плоду, ДНК-діагностика міодистрофії Дюшенна принципово може бути доповнена іммуноцітохіміческіе аналізом біоптатів скелетних м`язів плода.

В разі муковісцидозу додаткова інформація про стан плода може бути отримана при біохімічному дослідженні активності ферментів АЖ в 17-19 тижнів вагітності. Розроблений і широко застосовуваний в нашій лабораторії алгоритм ПД муковісцидозу наведено на малюнку.

Біохімічні методи в пренатальної діагностики

істотним обмеженням біохімічних методів в ПД є добре відомий факт, що про функціональний стан того чи іншого органу плоду або системи можна судити тільки після народження, коли закінчуються процеси термінальної диференціювання клітин спеціалізованих тканин, з одного боку, і коли припиняється зв`язок плоду з материнським організмом, який забезпечує трофіку і основні метаболічні процеси плода, - з іншого. Цього недоліку позбавлені розглянуті раніше цитогенетичні та молекулярні методи ПД. Проте біохімічні та деякі інші методи дослідження в окремих випадках виявляються корисними в системі ПД, хоча найчастіше відіграють допоміжну роль. Не можна, однак, виключити, що в міру все більш глибокого пізнання функції генів, утому числі абсолютно нових, ідентифікованих в процесі виконання програми «Геном людини», роль біохімічних методів в ПД буде зростати.

Найбільш часто матеріалом для біохімічних досліджень в ПД є АЖ, що отримується шляхом амніоцентезу. АЖ утворюється за рахунок секреторної активності клітин амніону на ранніх ембріональних стадіях розвитку і за рахунок первинної сечі плода - в більш пізні терміни. Кількісний та якісний склад навколоплідних вод регулюється компонентами системи амніон - мати - плід- порушення будь-якого з них призводить до надлишку або нестачі вод, впливає на біохімічний і клітинний склад АЖ.

Особливості біохімічного і клітинного складу АЖ на різних термінах вагітності детально розглянуті в спеціальних зведеннях і оглядах.

Відео: Генетичне обстеження вагітних

Клітини амніотіческоі рідини в біохімічному методі

Клітини АЖ використовуються в ПД не тільки для цитогенетичного аналізу, але і для виявлення деяких метаболічних хвороб, пов`язаних з дефектами обміну речовин. Некультивованих клітини АЖ можуть бути використані для ПД деяких спадкових дефектів обміну (НДО), коли за допомогою гістохімічних та електронно-мікроскопічних методів визначають специфічні включення, характерні для ряду хвороб накопичення. Подібні способи ПД описані для глікогенозу типу II, До появи ДНК-діагностики культура клітин АЖ довгий час була основним об`єктом ПД НДО.

Головна умова успішної ПД НДО - Точна інформація про первинному біохімічному дефекті, що лежить в основі захворювання. Більшість НДО успадковується по аутосомно-рецесивним типом, при якому обоє батьків є гетерозиготними носіями мутантного гена і з імовірністю 25% можуть мати хворих дітей.

біохімічний скринінг на гетерозиготное носійство для більшості НДО неможливий у зв`язку з відсутністю середніх значень концентрацій досліджуваних білків в нормі. Молекулярний скринінг невиправданий економічно, за винятком ряду невеликих етнічних груп, в яких частота певних мутацій істотно вище, ніж в основній популяції. Прикладом можуть служити гангліозідози GM2 типу IV у євреїв-ашке-нази, лізосомні хвороби типу сіалідо через та галактосіалідоза, які частіше зустрічаються у японців та італійців.

Для точної ПД НДО недостатньо знання клінічного діагнозу. Навіть при добре вивчених симптомах хвороби, наприклад при ряді гліколіпідозов і мукополисахаридозов, існують варіанти, зумовлені різними первинними біохімічними дефектами. Прикладом вираженою біохімічної гетерогенності є глікогеноз типу I. Тип I Авизван дефектом глюкозо-6-фосфатази, в той час як при типах В і С цього захворювання порушення функціонування ферменту обумовлені відсутністю інших білків, необхідних для нормального метаболізму глюкозо-6-фосфатази, а саме специфічних транслоказ. При цьому активність досліджуваного ферменту у одного з батьків може бути або істотно вище, або нижче середнього рівня і практично не відрізнятися від рівня, визначеного у самого хворого. Така псевдонедостаточность описана, зокрема для глобоідной лейкодистрофии.

Подібна варіабельність суттєво знижує ефективність ПД біохімічними методами. Для успішної ПД в таких випадках особливо важлива інформація про експресії дефектного білка або ферменту в різних тканинах. Ця інформація і визначає вибір оптимального біологічного об`єкта ПД. Первинний біохімічний дефект вивчався в різних тканинах тільки для деяких груп ферментів (наприклад, для лізосомних гідролаз). Крім того, відомо, що активність багатьох ферментів може варіювати в клітинах різних тканин в пре- і постнатальному періодах.

Методи встановлення біохімічного дефекту зазвичай пов`язані або з оцінкою активності ферменту, або з виявленням інших білків, що беруть участь в ферментативної реакції, або з визначенням продуктів, що накопичуються в результаті ферментативного блоку. У ряді спеціальних видань можна знайти докладний опис методів діагностики як давно відомих, так і порівняно недавно розроблених.

Основні спадкові хвороби, для яких можлива ПД на підставі біохімічного дослідження клітин АЖ або складу АЖ, наведені в таблиці.

Відео: Що таке скринінг. Лікувальний центр про скринінгу

кожній з перерахованих нозологічних форм захворювань відповідає свій первинний біохімічний дефект, тобто порушення того чи іншого ланки метаболізму, з`ясування якого і складає основну задачу біохімічної діагностики.

У зв`язку з швидким накопиченням знань про геном людини, ідентифікацією нових генів, дослідженнями їх мутацій і поліморфізмів, з одного боку, складністю і часто невизначеністю біохімічних результатів, важкодоступністю специфічних субстратів - з іншого, діагностика все більшого числа спадкових дефектів обміну проводиться з використанням більш універсальних і точних молекулярних методів аналізу. Список НДО, для яких вже розроблені молекулярні методи діагностики, наведено в монографії В.М. Горбунової та B.C. Баранова.

Проте деякі білки АЖ, перш за все так звані ембріоспеціфіческіе білки, тобто білки, характерні тільки для плода і в нормі не синтезуються в організмі матері, зберігають велике діагностичне значення. До таких білків в першу чергу слід віднести альфафетопротеин (АФП), ацетилхолінестеразою, білки мікроворсинок кишечника плоду і стероїдні гормони.