Розробка і використання методу серотипування для визначення циркулюючих генотипів вірусу гепатиту с.

Вірус гепатиту С (ГС) відноситься до возбудітелямс надзвичайно вираженою гетерогенністю популяції. Встановлено, що пацієнти з хронічним ГС, асоційованим з різними генотіпамівіруса, по різному відповідають на інтерферонотерапію.Определеніегенотіпов вірусу ГС важливо при проведенні епідеміологічних досліджень, так як дозволяє добре документувати передачу збудника.

Мета цього дослідження - оцінити возможностіметода серотипування для визначення генотипів вірусу ГС. Длясеротіпірованія був адоптіроваться оригінальний метод, опісаннийгруппой дослідників з Великобританії під керівництвом P.Simmonds (1993,1995). 12 коротких пептидів (18-19 амінокислотних залишків), що представляють епітопи NS4 білка 6 генотипів вірусу ГС, були получениметодом твердофазного синтезу, очищення за допомогою високоеффектівнойжідкостной хроматографії і використані в якості основи іммуносорбентадля проведення імуноферментного аналізу з сироватками содержащіміантітела до NS4 білку (анти-NS4) . Наявність анти-NS4 подтверждалосьв ІФА з сумішшю пептидів для серотипування або методом иммуноблоттинга (LiaTek HCV, Organon Teknika- Wellcozyme HCV Western Blot, Murex).

Специфічність визначення генотипів вірусу ГС разаработаннимваріантом серотипування вивчена при зіставленні результатів "сліпого" тестування панелі сироваток з 154 анти-NS4-позітівнихобразцов з відомими генотипами вірусу (за винятком 1 зразка), визначеними за допомогою RFLP за методикою описаної P.Pohjanpeltoet al. (1996) на кафедрі вірусології Гельсінського університету.

Для вивчення особливостей поширення варіантоввіруса ГС на деяких територіях Росії (Санкт-Петербург, Нижній Новгород, Уфа, Білгород) та суміжних країн (Білорусь, Казахстан, Грузія) методом серотипування були тестовані анти-NS4-позітівниесивороткі, отримані від 474 осіб, включаючи 157 донорів крові , 237 хворих на гепатит С та 80 осіб з груп ризику (внутрівенниенаркомани, онкогематологічні хворі, пацієнти центрів хроніческогогемодіаліза, туберкульозних стаціонарів і ін.).

Результати "сліпого" тестування 154 сиворотокс відомими генотипами вірусу гепатиту С по RFLP наведеної таблиці №1. В цілому серотіпіровано 148 зразків (96,1%). Полноесовпаденіе сіро і генотипів спостерігалося в 130 сироватках з 148 (87,8%). Для окремих генотипів цей показник виявився разлічним.Наібольшая частота збігу результатів відзначена для HCV-1 - (92,5%) з розкидом показника від 87,1% для сироваток субтіпа1в до 100% для сироваток зі змішаними субтипами 1а + 1в- для HCV- 3 94,3% (все сироватки ставилися до субтипу 3а). Найменший процентсовпаденія результатів спостерігався при тестуванні сироваток, що відносяться по RFLP до генотипу HCV-2 (80%). При серотіпірованіібило виявлено 5 сироваток, які можна було віднести до генотіпуHCV-4. Однак при порівнянні результатів з даними RFLP совпаденіеотмечено тільки в 2-х пробах (40%).

Висока кореляція результатів визначення генотіповвіруса ГС, отриманих двома абсолютно різними методами, позволілаіспользовать серотіпірованіе для вивчення циркуляції варіантоввіруса ГС на окремих територіях. Результати цієї частини ісследованійсумміровани в таблиці №2. В цілому на всіх вивчених терріторіяхвиявлена циркуляція 3 генотипів вірусу ГС, в одиничних случаяхв чотирьох регіонах визначено генотип HCV-4. Найбільш часто определялсягенотіп HCV-1 (від 47,1% у сироватках з Грузії до 74,4% - з Білорусії) Друге рангове місце по частоті виявлення займав практіческіна всіх територіях генотип HCV-3 (від 15,5% у сироватках з Белоруссіідо 34,0% - з Нижнього Новгорода). Значно рідше вивчені сивороткісодержалі типоспецифічні анти-NS4 HCV-2. Максимальна частотавиявленія цього генотипу була встановлена в сироватках з Білорусії (12,7%), Казахстану (13,7%), а мінімальна - в сироватках з Санкт-Петербурга (3,8%). У 35 сироватках, які представляють всі досліджувані регіони, при серотипування було встановлено наявність анти-NS4 різних генотипів (змішані генотипи). Найбільшу частку серед сироваток з смешаннимігенотіпамі склали зразки в яких одночасно определялісьHCV-1 і HCV-3 (26 з 35 - 74,3%), тобто найбільш часто встречающіесягенотіпи. Решта варіантів поєднань зустрічалися значітельнореже - HCV-1 + HCV-2 (8,6%), HCV-2 + HCV-3 (11,4%). Поєднання HCV-1 + HCV-4 виявлено в двох сироватках з Грузії (5,7%).

Матеріали цього дослідження свідетельствуюто тому, що використання синтетичних пептидів, соответствующіхантігенним детерминантам неструктурного білка NS4, в качествеосновного компонента імуносорбенту для ІФА дозволяє успешноопределять генотипи вірусу ГС в сироватках інфікованих етімвозбудітелем людей і проводити моніторинг за циркуляцією геноваріантоввозбудітеля в регіонах.

Для визначення генотипів вірусу ГС також іспользованметод ПЛР-RFLP з типоспецифічними рестрикційний ферментаміBst U1 і Bst N1 і подальшим аналізом продуктів рестрикції задопомогою горизонтального електрофорезу в 3% гелі агарози (ThiersV. Et al., 1997). Цим методом протестовані сироватки крові15 хворих на хронічний ГС, які отримували інтерферонотерапію. РНКвіруса ГС виявлена в 14 зразках, при цьому в 6 випадках (42,9%) встановлено субгенотіп 3а, в 3 (21,4%) - гентіп 1 (2 субгенотіп1в: 1 - субгенотіп 1а). РНК вірусу ГС, виділена з 4 образцовотносілась до рідко виявляються генотипам збудника - 4/5. Последніенаходкі вимагають подальшого ретельного вивчення.

Таблиця 1. СОПОСТAВЛЕНІЕ PЕЗУЛЬТAТОВ ОПPЕДЕЛЕНІЯГЕНОТІПОВ ВІPУСA ГЕПAТІТA З МЕТОДAМІ RFLP І СЕPОТІПІPОВAНІЯ

ПPІМЕЧAНІЕ: * - НЕ тіпіpовaлось ** - aбс.чісло / пpоцент

Таблиця 2. ЧAСТОТA ВИЯВЛЕННЯ PAЗЛІЧНИХ ГЕНОТІПОВВІPУСA ГЕПAТІТA З МЕТОДОМ СЕPОТІПІPОВAНІЯ НA ОТДЕЛЬНИХТЕPPІТОPІЯХ Pоссия І СОПPЕДЕЛЬНИХ СТPAНAХ

ПPІМЕЧAНІЕ: * - aбс.чісло сивоpоток з дaнним генотипом /% (нa 100 сивоpоток з укaзaнной територій)

література:

1. 1.Pohjanpelto P., Lappalainen M., Widell A. et al.// Clin.Diagn.Virol.-1996. -Vol.7. -P. 7-16
2. 2.Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A. et al.// J.Gen.Virol.-1993 Vol.74.-P. 2391 -2399