Лабораторний діагноз інфекційного захворювання

Загальні типи аналізів включають мікроскопію, тест-культуру, імунологічні тести (аналізи аглютинації, такі як латекс-аглютинація, імуноферментні аналізи, вестерн-блот, тести осадження і тести фіксації комплементу) і методи ідентифікації нуклеїнових і ненуклеінових кислот. Зазвичай тест-культура - це золотий стандарт для ідентифікації мікроорганізмів, але результати можуть бути недоступні протягом багатьох днів або тижнів. Крім того, хвороботворні мікроорганізми можуть бути виділені в культурі, що робить корисними альтернативні тести. Коли по болезнетворному мікроорганізму проведена тест-культура і він ідентифікований, лабораторія може також оцінити його чутливість до антибактеріальних препаратів.

Деякі тести (наприклад, фарбування за Грамом, звичайна аеробне культура) можуть виявити велику різноманітність хвороботворних мікроорганізмів. У той же час деякі збудники можуть бути не виявлені в аналізах. Тому клініцисти повинні знати про обмеження кожного тесту для конкретних мікроорганізмів. У таких випадках лікарі повинні запитувати аналізи, специфічні для підозрюваного патогена (наприклад, спеціальні барвники або середовище для культури) або рекомендувати лабораторії вибирати певні тести.

мікроскопія

Мікроскопія може бути зроблена швидко, але точність залежить від досвіду працівника лабораторії і якості обладнання. Інструкції часто обмежують використання лікарями мікроскопії в діагностичних цілях поза сертифікованої лабораторії.

Більшість примірників обробляють барвниками, які забарвлюють хвороботворні мікроорганізми, що виділяє їх на загальному тлі, хоча можуть використовуватися вологі препарати нефарбованих зразків, щоб виявити гриби, паразитів, інформативні клітини піхви, рухливі організми (наприклад, Trichomonas) і сифіліс (мікроскопією за методом темного поля ). Виявлення грибків може бути покращено застосуванням 10% -ної гідроксиду калію, щоб розчинити навколишні тканини і негрібковой організми.

Клініцист просить провести фарбування, засноване на ймовірних хвороботворних мікроорганізмів, але ніяке фарбування не є на 100% специфічним. Більшість зразків обробляють фарбуванням по Граму, а якщо підозрюються мікобактерії, то кислотостойким фарбуванням. Однак деякі хвороботворні мікроорганізми нелегко побачити при використанні цих методів. У таких випадках потрібні різні варіанти фарбування або інші методи ідентифікації. Оскільки мікроскопічне виявлення зазвичай вимагає концентрації мікроба приблизно 1х105 / мл, більшість примірників біологічних рідин (наприклад, ЦСР) концентрують (наприклад, центрифугуванням) перед проведенням аналізу.

Фарбування по Граму. Фарбування по Граму класифікує бактерії згідно з тим, чи зберігають вони кристалічну фіолетове забарвлення (грампозитивний - синій колір) чи ні (грамнегативний - червоний). Крім того, показує морфологію клітини (наприклад, бацили, коки) і її організацію (наприклад, скупчення, ланцюжки, діплоїден). Такі особливості можуть допомогти в попередньому виборі антибіотиків в очікуванні остаточної ідентифікації. Щоб провести фарбування по Граму, лаборанти нагрівають і фіксують матеріал зразка на предметному склі, а потім забарвлюють його послідовно по Граму барвником фіолетового кольору, йодом, ацетоном і контрастує барвником (як правило, сафранін).

Кислотостійкі і помірні (модифіковані) кислотостойкие барвники. Такі барвники використовуються, щоб ідентифікувати кислотостойкие організми (Mycobacterium sp.) І помірно кислотостойкие організми (перш за все Nocardia sp.). Ці барвники також корисні для фарбування Rhodococcus і подібних пологів, так само як ооцист деяких паразитів (наприклад, Cryptosporidium).

Хоча виявлення мікобактерій в мокроті вимагає тільки приблизно 5 000-10 000 мікроорганізмів / мл, мікобактерії часто присутні в організмі людини на більш низьких рівнях, таким чином, чутливість методу вельми обмежена. Зазвичай кілька мл мокротиння дезактивують гидроокисью натрію і концентрують центрифугуванням для кислотостойкого фарбування. Це покращує діагностику, хоча деякі помірно кислотостойкие організми важко відрізнити від мікобактерій.

флуоресцентне фарбування. Такі барвники дозволяють виявити збудників при більш низьких концентраціях (1х10⁴ клітин / мл). Приклади - помаранчевий акридин (бактерії і гриби), родамін аурамін і аурамін О (мікобактерії) і калькофлюор білий (гриби, особливо дерматофіти).

З`єднання флуоресцентного барвника з антитілом, спрямованим на хвороботворний мікроорганізм (пряма або непряма імунофлюоресценція), збільшує чутливість і специфічність діагностики. Однак ці аналізи важко читати і інтерпретувати, і мало хто (наприклад, прямі флуоресцентні аналізи антитіл Pneumocystis і Legionella) комерційно доступні і зазвичай використовуються.

фарбування тушшю. Цей барвник використовується, щоб виявити головним чином Cryptococcus neoformans і інші приховані грибки у суспензії відмитих клітин (наприклад, осад ЦСР). Забарвлюється другорядна область, а не організм безпосередньо, що дає можливість побачити будь-яку капсулу навколо організму як ореол. При інших збудників тест не настільки чутливий, як при виявленні криптококового антигену. Специфічність методу також обмежена: лейкоцити можуть здаватися прихованими збудниками.

Фарбування по Райту і Гимза. Такі барвники використовуються для виявлення паразитів в крові, Histoplasma capsulatum в фагоцитах і клітинах тканини, внутрішньоклітинних включень, сформованих вірусами і хламідіями, трофозоітов Pneumocystis jirovecii і деяких внутрішньоклітинних бактерій.

Тріхромное фарбування (забарвлення Гомори - Уитли) і фарбування залізним гематоксиліном. Ці барвники використовуються, щоб виявити кишкових найпростіших.

Барвник Гомори - Уитли використовується, щоб виявити мікроспоридії. Він може не виявити яйця гельмінтів і їх лічінкі- не завжди достовірно ідентифікує Cryptosporidium. Гриби і клітини людини також забарвлюються.

Залізний гематоксилін диференційовано забарвлює клітини, включення клітин і ядра. Яйця гельмінтів можуть змінити колір в темні кольори, що ускладнює ідентифікацію.

Культура

Тест-культура - зростання мікробів на живильному твердої або рідкої середовищі- збільшення числа організмів спрощує ідентифікацію. Культура також полегшує тестування антибактеріальної сприйнятливості.

Відео: Діагностика циститу. Частина 3 052-2506596

Зв`язок з лабораторією важлива. Хоча більшість зразків матеріалу висівають на середовище загального призначення (наприклад, кров або шоколадний агар), деякі хвороботворні мікроорганізми вимагають включення певних поживних речовин і інгібіторів або інших спеціальних умов-якщо один з цих хвороботворних мікроорганізмів підозрюється або якщо пацієнт приймав антибактеріальні препарати, потрібно про це повідомити в лабораторію. Про джерело зразка повідомляють такі дані, щоб лабораторія могла диференціювати збудників від нормальної мікрофлори.

Забір зразка важливий. Неправильний тип тампона може привести до хибно-негативних результатів. Дерев`яні стрижні палички для мазка токсичні деяких вірусів. Палички для мазка з ватним кінчиком токсичні для деяких бактерій і хламідій. Гемокультури вимагають дезактивації та дезінфекції шкіри (наприклад, мазку повідон йоду дають висохнути і видаляють 70% -ним спиртом). Зазвичай використовуються множинні зразки, кожен з окремого місця-паркан бажано проводити на висоті лихоманки, якщо це можливо. Нормальна флора шкіри і слизових мембран, яка росте навіть в одному зразку крові, інтерпретується як зараження. Якщо проба крові отримана з центральної вени або артерії, зразок периферичної крові також повинен бути взятий, щоб допомогти диференціювати системну бактериемию від інфекції катетера. Культури з заражених катетерів зазвичай стають позитивними більш швидко і містять більше організмів, ніж одночасно взяті культури периферичної крові. Деякі гриби, особливо грунту (наприклад, Aspergillus sp.), Як правило, не можуть культивуватися з зразків крові.

Зразок слід швидко транспортувати, в правильній середовищі і в умовах, які обмежують зростання будь-якої іншої потенційно заражає флори. Для точного визначення кількості хвороботворного мікроорганізму повинен бути відвернений додатковий патогенний ріст-екземпляри повинні бути негайно транспортовані в лабораторію або, якщо транспорт затримується, поміщені в холодильник (в більшості випадків).

Для певних культур існують особливі умови.

Анаеробні бактерії не повинні досліджуватися в тест-культурі, тому що диференціювання хвороботворних мікроорганізмів від нормальної флори найчастіше неможливо. Зразки проб повинні бути захищені від повітря. Для мазків використовуються анаеробні транспортні середовища. Зразки проб, зібрані за допомогою шприца (наприклад, вміст абсцесу), повинні транспортуватися в шприці.

Мікобактерії культивувати важко. Примірники, що містять нормальну флору (наприклад, мокротиння), повинні спочатку бути дезактивовані і сконцентровані. Mycobacterium tuberculosis і деякі інші мікобактерії ростуть повільно. Зростання М. tuberculosis, як правило, відбувається швидше в рідини, ніж в твердому середовищі. Зазвичай використання автоматизованих систем з рідким середовищем може привести до зростання в межах 2 тижнів у порівнянні з gt; 4 тижні на твердому середовищі (агар Ловенштейна - Дженсена). Крім того, в екземплярі може бути присутнім невелику кількість організмів. Забір декількох екземплярів з одного і того ж місця може допомогти збільшити ймовірність виявлення збудника. Протягом 8 тижнів засіяні середовища не можна викидати. Якщо підозрюється нетипова мікобактерія, про це слід повідомити лабораторію.

Віруси зазвичай культивуються по мазкам і зразкам тканини, зазвичай транспортуються в середовищах, які містять антибактеріальні і протигрибкові речовини. Вміст зразків проб інокуліруют в культуру тканин, які підтримують зростання вірусу і пригнічують все інші мікроби. Віруси, які дуже нестійкі (наприклад, вірус зостер), повинні інокулював в культуру тканин в межах 1 години після забору. Стандартна культура клітин тканин є найбільш чутливою. Прискорена культура клітин тканин (метод бляшок: підрахунок плям на клітинному монослое) може забезпечити отримання більш швидких, але орієнтовних результатів. Деякі поширені віруси можна виявити, використовуючи звичайні методи культури тканин-потрібні альтернативні методи діагностики.

Зразки грибів, отримані з нестерильних місць, повинні бути інокулював в середу, що містить антибактеріальні речовини. Примірники потрібно зберігати протягом 4 тижнів, перш ніж викинути.

Аналіз на чутливість

Аналізи на чутливість визначають стійкість мікроба до антибактеріальних препаратів шляхом впливу на нього стандартизованих концентрацій антибактеріальних препаратів. Аналіз на чутливість можна проводити для бактерій, грибів і вірусів. Для деяких організмів результати, отримані по одному препарату, пророкують результати по подібних ліків. Таким чином, не всі потенційно активні препарати перевіряються.

Аналіз на чутливість проводиться в пробірці і, можливо, не враховує багатьох факторів природних умов (наприклад, фармакодинаміку і фармакокінетику, особливість концентрації препарату в певних тканинах і органах, імунітет організму людини), які впливають на успіх лікування. Таким чином, результати аналізів на чутливість не завжди пророкують результат лікування.

Аналіз на чутливість може бути якісним, напівкількісним або з використанням методів виділення нуклеїнових кислот. Аналіз дозволяє також оцінити ефект спільного застосування різних антибактеріальних препаратів (тестування спільних ефектів).

якісні методи. Якісні методи менш точні, ніж напівкількісні. За результатами зазвичай фіксують чутливість (S), проміжний результат (I) або резистентність (R). Зазвичай використовується дисковий метод дифузії (також відомий як тест Кірбі - Бауера) підходить для швидко зростаючих організмів.

Просочені антибіотиком диски поміщають в агарові пластини, на яких знаходиться тестований мікроорганізм. Після інкубації (як правило, 16-18 ч) вимірюється діаметр зони пригнічення навколо кожного диска. У кожної комбінації антибіотик-мікроорганізм є різні діаметри, що мають значення S, I або R.

Інші методи, які вимагають менш чіткого дотримання параметрів аналізу, можуть використовуватися, щоб швидко перевірити резистентність окремого організму до окремого препарату або класу препаратів або до певних антибактеріальних комбінаціям (наприклад, резистентність до оксациллину у метицилін-резистентного стафілокока aureus, продукування В-лактамази).

напівкількісні методи. Напівкількісні методи визначають мінімальну концентрацію препарату, який гальмує зростання певного організму в пробірці. Цю мінімальну переважну концентрацію (МПК) фіксують як число, яке може потім бути враховано як одне з 3 груп: S (чутливий), I (проміжна ланка) або (резистентний) R. Визначення МПК використовується перш за все для бактерій, включаючи мікобактерії і анаероби , іноді використовується для грибів, особливо виду Candida, отриманих з стерильних місць. Мінімальна знешкоджуюча (бактерицидна) концентрація (МБК) може також бути визначена, але технічно це важко, і стандарти для інтерпретації ще не узгоджені. Цінність аналізу МБК полягає в тому, що він вказує, чи може препарат бути бактеріостатичну або бактерицидну.

Антибіотик може бути розчинений в агарі або бульйоні, в який потім додають мікроорганізм. Посветленіе бульйону - золотий стандарт, але він є трудомістким, тому що тільки одна концентрація препарату може бути перевірена в одній пробірці. Більш ефективний метод використовує стрип-смужку плівки з поліестеру, просочену антибіотиком у відповідній концентрації. Смужку кладуть на агарове платівку, яка містить вводиться матеріал, і МПК визначається за місцем на смужці, де починається інгібіція- велику кількість антибіотиків можна перевірити на одній платівці.

МПК дозволяє здійснити кореляцію між чутливістю мікроорганізму до препарату і досяжною концентрацією препарату в тканини, не пов`язаної з білком (вільне володіння препарат). Якщо концентрація в тканини вільного препарату вище, ніж МПК, то ймовірність успішного лікування висока. Точно так же дані про S, I і R корелюють з МПК. Вони зазвичай засновані на досяжною концентрації вільного препарату в сироватці або плазмі.

Методи виявлення нуклеїнових кислот. Ці аналізи, засновані на методах виявлення нуклеїнових кислот схожі на ті, які використовуються для ідентифікації мікроорганізму, але модифіковані, щоб виявити відомі резистентні гени або мутації. Приклад - mecA, ген резистентності до оксациллину у S. aureus- якщо цей ген присутній, то мікроорганізм вважають стійким до всіх -лактамних антибіотиків. Хоча відомо безліч таких генів, але їх виявлення не дає права однозначно судити про резистентності в природних умовах. Крім того, оскільки можуть бути присутніми нові мутації або інші гени резистентності, їх відсутність не гарантує чутливості до препарату. З цих причин і тому, що тести обмежені в числі і є дорогими, вони широко не застосовуються. Методи виявлення нуклеїнових кислот не замінили стандартну тест-культуру і звичайний аналіз на чутливість.

Імунологічні тести на інфекційне захворювання

Імунологічні тести використовують антиген, щоб виявити антитіла до болезнетворному мікроорганізму або використовують антитіло, щоб виявити антиген патогена в зразку пацієнта. Обробка змінюється, але якщо аналіз потрібно відстрочити, то зразок, як правило, слід помістити в холодильник або заморозити, щоб запобігти надмірно швидке зростання бактерій.

тести аглютинації. У тестах аглютинації (наприклад, латексна аглютинація, коаггрегація) частка (латексна намистинка або бактерія) з`єднується з антигеном або антитілом реагенту. Що виходять комплексна частка змішується зі зразком (наприклад, ЦСР, сироватка) - якщо шукане антитіло або антиген присутні в екземплярі, то настає перехресне зв`язування частинок у вигляді їх аглютинації, яку можна виміряти.

Якщо результати позитивні, досліджувана біологічна рідина послідовно розлучається і перевіряється. Аглютинація з більш розведеними розчинами вказує на більш високі концентрації цільового антигену або антитіла. Титр правильно фіксувати як реципрокний при аглютинації в самому розведеному розчинення наприклад, 32 вказує, що аглютинація відбулася в розчині, розведеному 1/32 від початкової концентрації.

Відео: Лаферобион

Зазвичай тести аглютинації швидкі, але менш чутливі, ніж багато інших методів. Вони можуть також визначати серотипи деяких бактерій.

фіксація комплементу. Цей аналіз вимірює споживання комплементу (фіксацію комплементу) у антитіла в сироватці або ЦСР. Тест використовується для діагнозу деяких вірусних і грибкових інфекцій, особливо кокцидіомікозу. Зразок інкубується при відомих кількостях комплементу і антигену. Ступінь фіксації комплементу вказує на відносну кількість антитіла в зразку. Аналіз може виміряти титри антитіла IgM та IgG або може бути модифікований, щоб виявити певні антигени. Аналіз точний, але має обмежене застосування, є трудомістким і вимагає численних засобів з контролю.

імуноферментний аналіз. Ці тести використовують антитіла, пов`язані з ферментами, щоб виявити антигени або виявити і визначити кількість антитіл. Імуноферментний аналіз (ІФА) і імуноферментний аналіз, пов`язаний з фермент-пов`язаним імуносорбент (ЕЛІЗА) є найбільш використовуваними. Оскільки чутливість більшості імуноферментних аналізів висока, то вони зазвичай застосовуються для скринінгу. Титри можуть бути визначені послідовним розведенням зразка, як і при тесті на аглютинацію.

Чутливість аналізу хоча зазвичай і висока, може змінюватися в залежності від віку пацієнта, серотипу мікроба, типу зразка або стадії клінічної хвороби.

Аналіз на осадження. Ці аналізи вимірюють антиген або антитіло в рідинах тіла ступенем видимого осадження комплексів антигену-антитіла в межах гелю (агароза) або в розчині. Є багато типів аналізу на осадження (наприклад, подвійна дифузія по Оухтерлони, протиточний іммуноелектрофорез), але їх застосування обмежене. Зазвичай проба крові змішується з тестованим антигеном, щоб виявити захисні антитіла, найчастіше при грибкової інфекції або пиогенная менінгіті. Оскільки позитивний результат вимагає великої кількості антитіла або антигену, чутливість низька.

Аналіз вестерн-блоту. Цей аналіз виявляє антибактеріальні антитіла в зразку матеріалу, взятому від пацієнта (наприклад, сироватка, інша рідина тіла) по їх реакції з антигенами (наприклад, вірусні компоненти), які були иммобилизировать на мембрану блоттинга.

У аналізу вестерн-блоту, як правило, хороша чутливість, хоча часто менша, ніж у скринінгових тестів, таких як ЕЛІЗА, але в загальному він має високу специфічність. Зазвичай використовується, щоб підтвердити позитивний результат, отриманий при скринінг-аналізі.

Технічні модифікації вестерн-блоту -Лінійний імунологічний аналіз (ЛІА) - рекомбінантний аналіз імуноблоту (RIBA), який використовує синтетичні або реком-бінант-продукують антігени- і імунохроматографічним аналіз, який може швидко перевірити зразки на певні мікробні антигени або антитіла хворого.

Методи ідентифікації ненуклеінових кислот для виявлення інфекційного захворювання

Як тільки організм був виявлений тест-культурою, він повинен бути ідентифікований. Методи виявлення ненуклеінових кислот використовують фенотипично (функціональні або морфологічні) властивості мікроорганізмів, а не генетичну ідентифікацію.

Особливості росту збудника на живильних середовищах - розмір колонії, колір і форма, дають інформацію для ідентифікації різновидів, а разом з фарбуванням по Граму і алгоритм для подальших аналізів. Доступні численні біохімічні тести- кожен характерний для мікроорганізмів певного типу (наприклад, аеробні або анаеробні бактерії). Деякі оцінюють здатність організму використовувати різні субстрати для росту. Інші оцінюють наявність або активність ключових ферментів (наприклад, коагулаза, каталаза). Аналізи роблять послідовно, крок за кроком. Послідовності тестів дуже різноманітні, тому вони можуть в різних лабораторіях.

Методи виявлення ненуклеінових кислот можуть бути засновані на роботі вручну, на автоматизованих системах чи це можуть бути хроматографічні методи. Деякі комерційно доступні комплекти містять батарею окремих тестів, які можуть бути проведені при одночасному використанні одного зразка матеріалу і, як правило, корисні для діагностики широкого кола мікроорганізмів. Такі системи аналізу можуть бути дуже точними, але можуть вимагати певного часу, аж до декількох днів.

хроматографічні методи. Мікробні компоненти або продукти відокремлюються і ідентифікуються при використанні високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) або газової хроматографії. Зазвичай виявлення йде шляхом порівняння жирних кислот організму з базою даних. Хроматографічні методи можуть використовуватися, щоб ідентифікувати аеробні та анаеробні бактерії, мікобактерії і гриби. Точність аналізу залежить від якості тест-культури зразка і якості бази даних, яка може бути неточною або неповною.

Методи ідентифікації інфекційного захворювання, засновані на виявленні нуклеїнових кислот

Засновані на виявленні нуклеїнових кислот методи виявляють певні для організму послідовності ДНК або РНК, витягнуті з мікроорганізму. Послідовності можуть бути ампліфікувати в пробірці. Засновані на виявленні нуклеїнових кислот методи є в цілому специфічними і дуже чутливими і можуть використовуватися для всіх категорій мікробів. Результати можуть бути отримані швидко. Оскільки кожен аналіз, як правило, є специфічним для певного організму, клініцист повинен знати діагностичні можливості і запитувати відповідний аналіз. Наприклад, якщо у пацієнта є симптоми, які передбачають грип, але сезон грипу закінчився, проведення більш загального вірусного діагностичного аналізу (наприклад, вірусна культура), а не певного аналізу на грип краще, тому що інший вірус (наприклад, парагрип, аденовірус) може бути причиною.

Засновані на визначенні нуклеїнових кислот тести якісні, але кількісні методи визначення існують для обмеженого, але збільшує числа інфекцій (наприклад, ВІЛ, цитомегаловірус, Т-лімфотропний вірус людини). Ці методи можуть бути корисними для діагнозу і для моніторингу відповіді на лікування.

Методи, що не задіють амплификацию нуклеїнової кислоти, використовуються в тих випадках, коли організм був спочатку виявлений в тест-культурі і присутній в зразку у високій концентрації.

ампліфікація. При методах ампліфікації нуклеїнових кислот беруть крихітне кількість ДНК або РНК, відтворюють їх багато разів, і таким чином можуть виявити невеликі сліди мікроорганізму в зразку. Ці методи особливо корисні для збудників, які важко культивувати або ідентифікувати використанням інших методів (наприклад, віруси, внутрішньоклітинні хвороботворні мікроорганізми, гриби, мікобактерії, деякі інші бактерії), або для тих організмів, які присутні в малих кількостях.

Ці аналізи можуть задіяти цільову амплификацию (наприклад, ПЦР, зворотна транскриптаза-ПЛР [RT-PCR], ампліфікація зміщення ланцюга, ампліфікація транскрипції), ампліфікації сигналу (наприклад, аналіз розгалуженої ДНК, гібридний захоплення), ампліфікації проби (наприклад, ланцюгова реакція лігази , впроваджуються вид розщеплення, циклічні проби) або аналіз постампліфікаціі (наприклад, упорядкування амплифицированного продукту, аналіз мікроматріц і аналіз кривої ліквідусу, як це робиться в ПЛР в реальному часі).

Відповідний забір зразка і його зберігання до прибуття в молекулярну діагностичну лабораторію важливі. Оскільки методи ампліфікації настільки чутливі, легко можуть бути встановлені помилкові позитивні результати від сліду зараження зразка або обладнання. Незважаючи на високу чутливість, іноді трапляються помилкові негативні результати, навіть коли у пацієнта є клінічні симптоми (наприклад, при вірусної інфекції Західного Нілу). Помилково негативні результати можуть бути мінімізовані

• шляхом уникнення використання паличок для мазків з дерев`яними стерженьками і наконечниками з вати,
• швидкоїтранспортуванням зразків,
• заморожуванням або приміщенням зразків в холодильник, якщо транспортування займе gt; 2 ч.

Заморожування - типовий метод зберігання аналізів ампліфікації нуклеїнових кислот. Однак зразки повинні зберігатися в холодильнику, а не піддаватися заморожуванню, якщо підозрюються нестійкі віруси (наприклад, вірус герпес-зостер, вірус грипу, ВІЛ-2) або якщо планується дослідження вірусних культур (заморожені екземпляри не годяться для стандартних культур).