Медичне законодавство: права, документи, обов`язки, норми, акти.

Додаток N 6УТВЕРЖДЕНОПріказ МОЗ Россііот 09.01.1998 р N 2ІНСТРУКЦІЯПО видалення з СИРОВАТКИ АНТІРЕЗУСАНТІТЕЛ ІНШИЙ СПЕЦІФІЧНОСТІОбщіе сведеніяо практичній роботі по визначенню резус-прінадлежностікрові найбільшу зручність представляє використання сиворотокантірезус групи крові АВ (IV), несодержащіхгрупповихагглютінінов альфаібета.Такіесивороткіявляютсяуніверсальнимі, так як дозволяють визначати резус-прінадлежностьв крові будь-якої групи за системою АВО.Сивороткі антирезус, що належать до груп О (I), А (II) верб (III), також можуть бути перетворені в універсальні путемабсорбціі або нейтралізації в них групових агглютінінов альфа ібета.Помімо групповихагглютініновіспользованіюсивороткіантірезус заважають також наявні в окремих випадках ізоіммунниеантітела інший специфічності, найчастіше анти-С і анти-Е. Есліеті антитіла мають низький титр, вони можуть бути видалені при помощіабсорбціі або шляхом розведення сивороткі.Іспользованіе універсальних сироваток антирезус упрощаетработу, підвищує ефективність лабораторної служби та ісключаетполученіе помилкових результатів через невідповідність групписивороткі антирезус і досліджуваних ерітроцітов.Для звільнення сироватки антирезус від агглютінінов альфа, бета і від антитіл анти-С і анти-Е можна застосовувати різні способи: а) нейтралізацію групових агглютінінов альфа і бетасоответствующім груповим речовиною, що містяться в амніотіческойжідкості (див. п. 1) -б) нейтралізацію групових агглютінінов альфа і бетаестественним груповим речовиною а і в (субстанція Вітебського) (див. п. 2) -в) абсорбціюгрупповихагглютініновальфаі бетарезус-негативними еритроцитами, що знаходяться в пакунках кровіпосле зняття з них сироватки (див. п. 3) -г) нейтралізацію групових агглютінінов альфа і бета путемразведенія сироватки (див. п . 4)-д) абсорбцію антитіл анти-С і анти-Е еритроцитами етойспеціфічності (див. п. 5) -е) нейтралізацію антитіл анти-С і анти-Е шляхом разведеніясивороткі (див. п. 6) .1. Нейтралізація групових агглютінінов альфа і бета при помощіамніотіческой жідкостіlt; * gt; Амніотична рідина содержітраствореннуюгрупповуюсубстанцію, відповідну групі крові плоду. Вона може бутивикористана як в нативному вигляді, так і попередньо висушеннаяі потім розчинена дистильованою водою (отримання і обработкуамніотіческой рідини см. П. 8) .---------------------- ---------- lt; * gt; - Амніотична рідина нейтралізує альфа і бетаантітела, що відносяться до класу lgМ, неповні альфа і бетаантітела, що відносяться до класу lgG, при цьому не нейтралізуются.Для нейтралізації агглютінінов альфа і бета в сивороткеантірезус групи Оальфа бета (I) використовують амниотическую жідкостьгруппи АВ (IV) або суміш зразків амніотичної рідини групи (II) і В (III). Для нейтралізації агглютінінов бета в сивороткегруппи Абете (II) використовують амніотичну рідину групи В (III) .Для нейтралізації агглютінінов альфа в сироватці антирезус группиВальфа (III) використовують амніотичну рідину групи А (II) .Для повного виснаження групових агглютінінов в ісходнойсиворотке антирезус проводять підбір оптимального соотношеніяамніотіческой рідини і нейтралізуемой сироватки антирезус, длячого: - в штатив встановлюють п`ять пробірок з позначеннями 1: 2,1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, в усі пробірки вносять по 2 капліамніотіческой рідини - нативной або розчиненої послевисушіванія - в першу пробірку додають 4 краплі нейтралізуемойсивороткі, в другу 6 крапель, в третю - 8 крапель, в четверту -10 крапель, в п`яту - 12 капель-- вміст пробірок перемішують і залишають на 10 хвилин прікомнатной температуре-- після 10-хвилинної експозиції суміш з кожної пробіркіконтроліруют на площині наполноту нейтралізаціісостандартнимі резус-негативними еритроцитами, содержащіміантіген, відповідний нейтралізуемой агглютінінам-- останнє розведення, в якому відсутня аглютинація (час спостереження 5 хвилин), приймається за оптимальне соотношеніеамніотіческой рідини і нейтралізуемой сивороткі-- якщо аглютинація відсутня в усіх розведеннях, готовятразведенія 1: 7, 1: 8, 1: 9 і продовжують дослідження, як сказановише-- після того, як вибрано оптимальне співвідношення, до основномуоб`ему сироватки антирезус додають відповідну колічествоамніотіческой рідини і перемішують їх. Через 10-20 хвилин послеперемешіванія знову перевіряють сироватку на повноту абсорбції наплоскості з 6-8 зразками резус-негативних еритроцитів группиА (II) і В (III) - далі сироватку досліджують і обробляють відповідно до"Інструкцією по виготовленню стандартних сироваток і реагентаантірезус".Прімечаніе: З метою спрощення отримання універсальних сироваток ізсивороток антирезус групи Абете (II) і Вальфа (III) їх можнопредварітельносмешівать, чтопозволяетнейтралізоватьодномоментно аглютиніни альфа і бета амніотичної жідкостьюгруппи АВ (IV) або сумішшю амніотичної рідини групи А (II) ігруппиВ (III). Попереднє змішування сивороткіпротівоположних груп доцільно ще й тому, що при етомпроісходітчастічнаявзаімнаянейтралізація групповихагглютінінов, що знижує кількість амніотичної рідини, необхідне для повної нейтралізації, а, отже, сніжаетсястепень розведення абсорбіруємой сивороткі.Іспользованіе висушеної амніотичної жідкостіПрі низькому титрі сироватки антирезус, який обмежує ееразведеніе, для нейтралізацііагглютініновцелесообразноіспользовать сухий порошок . До нейтралізації приступають так само - зпевним оптимального співвідношення сироватки антирезус і сухогопорошка, отриманого з амніотичної рідини, для чого: - в штатив встановлюють чотири пронумеровані пробірки, вкоторие вносять по 0,5 мл сироватки антірезус-- в першу пробірку додають 2 мг висушеної амніотіческойжідкості, в другу - 4 мг, в третю - 8 мг і в четверту - 16 мг.Содержімое пробірок перемішують до повного розчинення порошку іоставляют при кімнатній температуре-- через 10 хвилин проводять випробування на площині на полнотунейтралізаціі з еритроцитами груп А (II) і в ( III) і вибіраютоптімальное співвідношення інгредіентов-- вибране співвідношення використовують для виготовлення основногооб`ема сивороткі-- далі сироватку досліджують і обробляють відповідно до"Інструкцією по виготовленню сироваток і реагенту антирезус".2. Нейтралізація групових агглютінінов альфа і бетаестественнимі груповими речовинами специфічності А і В (субстанція Вітебського) Групові спеціфіческіевеществаАіВявляютсявисокомолекулярнимі полісахариди, готуються впроізводственних умовах з слизової оболонки свинячих і лошадінихжелудков шляхом їх ферментативного перетравлення з последующімосажденіем і очищенням органічними розчинниками. Колічествогруппового специфічного речовини, необхідного для нейтралізацііантітел в сироватці, залежить від активності речовини. Длянейтралізаціі групових агглютінінов до сироватці антірезусдобавляют групове специфічне речовина з розрахунку: - до 1000 мол сироватки антирезус групи О (I) - 0,1 г групповоговещества А і 0,1 г - групового речовини В- до 1000 мол сироватки антирезус групи А (II ) - 0,1 ггруппового речовини в-до 1000 мол сироватки антирезус групи в (III) - 0,1 г групповоговещества А.Для розчинення групового речовини необхідне його колічествосначала розтирається скляною паличкою в пробірці або на часовомстекле з невеликою кількістю (1 мл) сироватки антирезус, підігрітою до 37ш С, потім це групове речовина переносять вобще кількість сироватки антирезус, ретельно багаторазово смиваяего сироваткою з скла. Сироватку антирезус перемішують сгрупповим речовиною і поміщають в термостат на 3 години, перемешіваякаждие 30 мінут.После цього сироватку поміщають в холодильник при 4ш З неменш, ніж на три доби, а потім досліджують на платівці наутримання групових агглютінінов з 6-8 образцамірезус-негативної крові групи А (II) і В (III) .Отсутствіе аглютинації означає, що групові агглютініниполностью нейтралізовані. Наявність аглютинації означає неполнуюнейтралізацію групповихагглютінінов.Вслучае неполнойнейтралізаціі групових агглютінінов до сироватці знову добавляюттакое ж або більшу (до 0,5 г) кількість групового речовини ився процедура повторяется.Прі повної нейтралізації групових агглютінінов сивороткуісследуют і обробляють далі відповідно до "Інструкцією поізготовленію стандартних сироваток і реагенту антирезус".3. Абсорбція групових агглютінінов резус-отріцательниміерітроцітамі на пакунках крові групи АВ (IV) Неотмитие згортки крові групи АВ (IV), що залишилися послеотсасиванія сироватки антирезус, допустимо зберігати при 4-8ш З напротязі 1-2 суток.Для абсорбції охолоджений згорток подрібнюють при помощістеклянной палички і додають до нього також охолоджену сивороткуантірезус в кількості 1 / 6-1 / 3 об`єму по відношенню до об`єму, що займають подрібненим згортком (до 300 мл згортка прілівают50-100 мл абсорбіруємой сироватки, в залежності від актівностігруппових антитіл). Сироватку, ретельно змішану зі згортком, залишають на 18-20 годин при 4-8ш С, після чого відокремлюють отсвертка шляхом центріфугірованія.Далее сироватку перевіряють на площині з 6-8 зразками резус-негативних еритроцитів і в разі повної абсорбції групповихагглютінінов обробляють і досліджують далі відповідно до"Інструкцією по виготовленню сироваток і реагенту антирезус".4. Нейтралізація групових агглютінінов альфа і бетапрі допомоги розведення сивороткіДля нейтралізації сироватку антирезус розводять ізотоніческімраствором NaCl спеціально підібраною сироваткою групи АВ (IV) ілістандартним разводітелем.Нейтралізація групових антитіл за допомогою розведення возможнатолько лише при великому розходженні титру групових і резус-антітел.Напрімер, якщо титр групових антитіл 1: 8, сироватку следуетразвесті не менше, ніж в 16 разів, що можливо тільки в тому випадку, якщо титр резус-антитіл в ній після розведення збереглися не ніжетребованій, що пред`являються до стандартної сироватці антірезус.В процесі роботи на початку слід приготувати пробниеразведенія сироватки антирезус і досліджувати титр резус-антитіл, атакож ступінь нейтралізації групових антитіл з 6-8 образцамірезус-негативних еритроцитів групи А (II) і В (III) .При збереженні достатнього титру резус-антитіл і полнотеабсорбціі групових антитіл розводять основний обсяг сивороткіантірезус і далі досліджують її і обробляють відповідно до"Інструкцією по виготовленню сироваток і реагенту антирезус".5. Видалення з сироватки антирезус супутніх антітеланті-С і анти-Ееслі на будь-якій стадії обробки сироватки антирезус-Dвияснітся, що в ній містяться ще й інші антитіла антирезус, останні можуть бути вилучені шляхом абсорбції або разведеніясивороткі.Абсорбція проводиться тричі відмитим еритроцитами, взятиміпріблізітельно в половинному обсязі по відношенню до сироватці. Еслів сироватці є домішка антитіл анти-С, то для абсорбцііпріменяются еритроцити фенотипу Ccddee, а якщо є прімесьанті-Е, то еритроцити фенотипу ccddEe. Абсорбція проводиться напротязі 2-3 годину. при температурі 37ш С при помішуванні зподальшим перевіркою сироватки на специфічність і актівность.Еслі супутні антитіла не пішли, сорбцію можна повторіть.Разведеніе сироватки антирезус для видалення сопутствующіхантітел можна проводити при титрі антитіл анти-D не нижче, чем1: 128 - 1: 256 і титрі супутніх антитіл не вище 1: 2.Сиворотку антирезус розводять фізіологічним розчином NaCl, сироваткою - разводітелем або стандартним разводітелем.В початку слід зробити пробні порції, які ісследоватьна повноту нейтралізації супутніх антитіл і на сохранностьдостаточного титру резус-антитіл-D. При позитивному результатеразводят основний обсяг сироватки. Як після абсорбції, так іпосле розведення основного обсягу сироватки її знову обрабативаються досліджують далі відповідно до "Інструкцією по ізготовленіюстандартних сироваток і реагенту антирезус".6. Отримання і обробка амніотичної рідини длявикористання її при виготовленні сироваток антірезусАмніотіческую рідина збирають в пологових будинках від каждойроженіци окремо в чисті флакони. Від однієї породіллі може битьполучено від 100 до 1500 мл. На етикетці флакона вказують фаміліюроженіци, дату взяття, кількість і по можливості групу кровіноворожденного.Групповая приналежність амніотичної рідини соответствуетгруппе крові новорожденного.Оплата засборамніотіческойжідкостіпроізводітсяучрежденіямі служби крові аналогічно оплаті за ретроплацентарнуюкровь з коштів на заготівлю крові.Подготовка амніотичної рідини до іспользованіюГрупповую приналежність амніотичної рідини устанавліваютпутем визначення групової приналежності крові новорожденногоілі методомістощеніяагглютініновальфаібета вгемагглютінірующей сироватці групи О (I). Для цього в пробіркесмешівают рівні об`єми (по 1 мл) стандартної гемагглютінірующейсивороткі з титром 1:32 і випробуваної амніотичної рідини. Смесьперемешівают і залишають на 10 хв. при кімнатній температуре.Затем суміш сироватки та амніотичної рідини досліджують наплоскості зі стандартними еритроцитами групи А (II) і В (III) .Співвідношення еритроцитів і суміші має відповідати прімерно1: 10, експозиція 5-7 мінут.Трактовка результатів- Наявність аглютинації в краплях з еритроцитами групи А (II) ігруппи в (III) вказує на відсутність в амніотичної жідкостігруппових антигенів А і в, тобто на приналежність її до группеО (I). Така амніотична рідина не придатна для нейтралізаціігруппових агглютінінов.- Відсутність аглютинації у краплі з еритроцитами групи А (II) і наявність аглютинації у краплі з еритроцитами групи В (III) вказує на приналежність амніотичної рідини до групи А (II) .- Відсутність аглютинації у краплі з еритроцитами групи в (III) і наявність її з еритроцитами групи А (II) вказує напрінадлежность амніотичної рідини до групи в (III) .- Відсутність аглютинації в краплях як з еритроцитами группиА (II), так і групи в (III) вказує на прінадлежностьамніотіческой рідини до групи АВ (IV) .Групповую приналежність записують на етикетці, которуюнаклеівают на флаконі з амніотичної жідкостью.Контроль амніотичної рідини на спеціфічностьСледует враховувати можливість попадання в амніотіческуюжідкость крові породіллі, в зв`язку з чим необхідно ісследоватькаждий зразок амніотичної рідини на наявність групповихагглютінінов.Ісследованіе амніотичної рідини з еритроцитами группиА (II) і в (III) проводиться аналогічно визначенню групповойпрінадлежності крові.Налічіе аглютинації означає наявність в амніотичної жідкостігруппових агглютінінов крові породіллі. Такий зразок непрігодендля работи.Фільтрація та консервування амніотичної жідкостіПосле визначення групової приналежності і контролю наспеціфічность амніотичну рідину фільтрують через обичнийбумажний фільтр або під вакуумом через порцелянову лійку Бюхнера, в яку поміщають подрібнену фільтрувальну папір толщіной5-7 мм. Після фільтрування амніотична рідина становітсяпрозрачной.Консервірованіе проводиться борною кислотою з розрахунку 2 грна 100 мл або азидом натрію 1 г на 1000 мл.Срок зберігання амніотичної рідини 12 місяців при 4-8ш С.Висушіваніе амніотичної жідкостіС метою подовження терміну придатності амниотическую жідкостьвисушівают по 150-200 мл у флаконах місткістю 250-500 мл. Нафлакони наклеюють етикетки із зазначенням групи амніотіческойжідкості за системою АВО, її початкової кількості і дативисушіванія.Висушенную амніотичну рідину зберігають при комнатнойтемпературе. Термін придатності 5 років. Висушену амніотіческуюжідкость перед вживанням розводять дистильованою водою доісходного обсягу. Після розчинення використовують аналогічнонатівной.Методіческіе рекомендації "Видалення з сироватки антірезусантітел другойспеціфічності", Затверджені Міністерствомздравоохраненія СРСР 27 листопада 1990 року N 10-11 / 136, счітатьутратівшімі силу з моменту затвердження даної інструкціі.Начальнік Управленіяорганізаціі медіцінскойпомощі населеніюМінздрава РФА.І.ВЯЛКОВПріложеніе N 7УТВЕРЖДЕНОПріказ МОЗ Россііот 09.01.1998 р N 2ІНСТРУКЦІЯПО ВИЗНАЧЕННЯ резус-ПРИЛАДДЯ КРОВІI. ВВЕДЕНІЕОпределеніе резус-приналежності полягає у виявленні верітроцітах людей антигену D системи Резус.В систему Резус входять шість антигенів: D, d, C, c, E, e, які визначають за допомогою відповідних антісивороток.Антіген d серологічно не виявляється. Існують такжеразновідності антигенів резус: Du, Cw, cv, cx і другіе.Антігени системи Резус зустрічаються з наступною частотою: D - 85% C - 70% c - 80% E - 30% e - 97,5% Антигени системи Резус мають способностьювизиватьобразованіе ізоімунному антітел.Наіболее активним в цьому відношенні є антиген D, которийі мається на увазі під терміном резус-фактор. Саме по налічіюілі відсутності антигену D все люди діляться на резус-положітельнихі резус-отріцательних.Разлічние поєднання антигенів резус в крові окремих людейсоставляют 28 груп системи Резус (Табл. 1). У чотирнадцяти з ніхсодержітся антиген D - вони є резус-позитивними, а другіечетирнадцать не містять антигену D (нижня частина таблиці) - іхотносят до резус-отріцательним.Табліца 1СІСТЕМА резус + ----- + --------- -------------------------------------------------- - + | N | Резус-позитивні || + ---------------------- + ------------- + ---------- + - ----------- + | п / п | фенотип | Частота в% | Генотип | Частота в% | + ----- + ---------------------- + ------------- + ---------- + ------------ + | 1-2 | CCDEE CwCDEe | 0,00 | || + ----- + ---------------------- + ------------- + ---- ------ + ------------ + | 3 | ССDEe | 0,07 | CDE / CDe || + ----- + ---------------------- + ------------- + - --------- + ------------ + | 4 | CcDEE | 0,035 | CDE / cdЕ | 0,006 || | | | cDE / CdE | 0,029 | + ----- + ---------------------- + ------------- + ---------- + ------------ + | 5 | CcDEe | 13,69 | CDe / cDE | 12,24 || | | | CDE / cDe | 0,01 || | | | CDe / cdE | 0,97 || | | | cDE / Cde | 0,27 || | | | CDE / cde | 0,19 || | | | cDE / cdE | 0,006 | + ----- + ---------------------- + ------------- + ---------- + ------------ + | 6 | CwcDEe | 1,23 | || + ----- + ---------------------- + ------------- + ---- ------ + ------------ + | 7 | ccDEe | 11,82 | cDE / cde | 10,04 || | | | cDE / cDe | 0,72 || | | | cDe / cdE | 0,06 | + ----- + ---------------------- + ------------ - + ---------- + ------------ + | 8 | ccDEE | 2,49 | cDE / cDE | 2,16 || | | | cDE / cdE | 0,33 | + ----- + ---------------------- + ------------ - + ---------- + ------------ + | 9 | CcDee | 31,93 | Cde / cde | 29,90 || | | | CDe / cDe | 1,98 || | | | cDe / Cde | 0,05 | + ----- + ---------------------- + ------------- + - -------- + ------------ + | 10 | CwcDee | 2,38 | || + ----- + ---------------------- + ------------- + ---- ------ + ------------ + | 11 | CCDee | 16,81 | CDe / Cde | 16,01 || | | | CDe / Cde | 0,80 | + ----- + ---------------------- + ------------- + - -------- + ------------ + | 12 | CwCDee | 2,60 | || + ----- + ---------------------- + ------------- + ---- ------ + ------------ + | 13 | CwCwDe | 0,00 | || + ----- + ---------------------- + ------------- + ---- ------ + ------------ + | 14 | ccDee | 2,21 | СDE / cde | 2,10 || | | | cDe / cDe | 0,11 | + ----- + ---------------------- + ------------- + - -------- + ------------ + | Резус-негативні | + ----- + ---------------------- + ------------- + - -------- + ------------ + | 15 | ccddee | 12,71 | cde / cde || + ----- + ---------------------- + ------------- + - --------- + ------------ + | 16 | Ccddee | 1,54 | Cde / cde || + ----- + ---------------------- + ------------- + - --------- + ------------ + | 17 | CCddee | 0,03 | Cde / Cde || + ----- + ---------------------- + ------------- + - --------- + ------------ + | 18 | Cwcddee | 0,035 | Cwde / cde || + ----- + ---------------------- + ------------- + - --------- + ------------ + | 19 | ccddEe | 0,070 | cde / cdE || + ----- + ---------------------- + ------------- + - --------- + ------------ + | 20 | CcddEe | 0,35 | Cde / cdE || + ----- + ---------------------- + ------------- + - --------- + ------------ + | 21-28 | CwCddee CwCwddee | | ||| | ccddEECcddEE | 0,00 | ||| | CCddEECCddEe | | ||| | CcddEeCwCddEe | | || + ----- + ---------------------- + ------------- + ---- ------ + ------------ + II. ЗАГАЛЬНІ ЗАМЕЧАНІЯ1. Визначення резус-прінадлежності.Определеніе резус-приналежності проводиться фахівцем, що має спеціальну подготовку.Определеніе резус-прінадлежностіреціпіентов проізводітсястандартной сироваткою анти-D, що дає можливість розділити їхна резус-позитивних (Rh +) і резус-негативних (rh -). На відміну від реципієнтів визначення резус-прінадлежностікрові донорів проводиться в два етапи: спочатку кров доноровісследуется стандартної сироваткою анти-D, а потім кров донорів, яка дала негативну реакцію з сироваткою анти-D, ісследуютдополнітельно стандартними сироватками антирезус, содержащіміантітела анти-с і анти-Е. Антитіла анти-С і анти-Е можуть бути всиворотке як в чистому вигляді, так і в поєднанні з антітеламіанті-D, наприклад: анти-D + C, анти-D + E або анти-D + C + E.В число резус -негативних донорів зараховуються тільки особи, кров яких дає негативну реакцію з усіма сироватками, тобто. не містить жодного з цих трьох антигенів резус D, C, E.Іногда такі додаткові дослідження потрібно проводити иу інших осіб - у хворих з підозрою на ізосенсібілізаціі і убеременних женщін.Результат визначення резус-приналежності крові доноровзапісивается в спеціальних аркушах або журналі і на особовому лістедонорского журналу (картці) із зазначенням дати і за підписом осіб, які проводили определеніе.Результат визначення резус-приналежності крові хворих идругих осіб записується в спеціальний журнал і на бланку суказанием дати і за підписом осіб, які проводили визначення. Етотбланк вклеюється в історію хвороби і, крім того, результат, зазначений на цьому бланку, записується лікарем в правомверхнем кутку лицьового аркуша історії хвороби і скріплюється егоподпісью із зазначенням дати.2. Облік групової належності сироватки антірезус.Сивороткі антірезусізготавліваютсяобичнов вигляді"універсальних", Тобто позбавлених групових антитіл анти-А і анти-В.Такіе сироватки придатні для визначення резус-прінадлежностікрові людей будь-якої групи за системою АВО.Однако, якщо виготовляються сироватки антирезус різних групппосістеме АВО, то в цих випадках при определеніірезус-приналежності необхідно враховувати групову спеціфічностьсивороткі. Сироваткою антирезус групи О (I) определяетсярезус-приналежність тільки в еритроцитах групи О (I) - сивороткойантірезус групи А (II) - тільки в еритроцитах груп О (I) і А (II) -сивороткой антирезус групи В (III) - тільки в еритроцитах групи (I) і В (III) - сироваткою антирезус групи АВ (IV) і спеціальнопріготовленной "універсальної" резус-приналежність визначається верітроцітах групи АВ (IV) і будь-який інший групи крові.3. Контрольні ісследованія.Прі кожному дослідженні або проведеної серії ісследованійнеобходімо для перевірки специфічності і активності сивороткіантірезус ставити контроль. Для контролю застосовуються стандартниерезус-позитивні еритроцити групи О (I) або тієї ж групи, щоі досліджувана кров, і стандартні резус-негативні ерітроціти.О стандартних еритроцитах см. "Інструкцію з узяття і учетукрові, одержуваної від донорів малими дозами для пріготовленіястандартних еритроцитів".4. Особливості стандартних сироваток антірезус.Стандартние сироватки для визначення резус-прінадлежностімогут містити резус-антитіла, різні за формою - повні інеполние (див. "Інструкцію по дослідженню сироватки на налічіерезус-антитіл"). Кожні з цих антитіл активні тільки в особихусловіях, тому методика визначення резус-прінадлежностізавісіт від того, які резус-антитіла знаходяться в стандартнойсиворотке.Метод використання кожної стандартної сироватки антірезусуказивается в супровідній інструкціі.III. РІЗНІ МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ резус-ПРІНАДЛЕЖНОСТІМетод визначення резус-приналежності залежить від формиантітел в стандартній сироватці та способу її ізготовленія.Прі видачу сироватки антирезус до неї надається краткаясопроводітельная інструкція з описом того методу, для которогопредназначена дана серія видається сивороткі.1. Визначення резус-належності реакцією конглютинації з застосуванням желатину в пробірці з підігрівом 46-48ш С.А) Спеціальне оснащеніе.Стандартная сироватка антирезус анти-D з неповними антітеламі.Стандартние еритроцити Rh + і rh- для контроля.Центріфужние або інші пробірки місткістю 10 мл.Водяная баня 46-48ш С. суховоздушной термостат 46-48ш С.10% розчин желатину. (Желатин можна зберігати з консервантом- Сульфацилу натрію (альбуцид) - з розрахунку 100 мг альбуциду на10 мл 10% розчину желатину) .Лупа з 2-4-кратним увеліченіем.б) Попередня обробка досліджуваної крові і стандартнихерітроцітов. Кров для дослідження слід брати в колічестве5-8 мл в пробірку без стабілізатора. На пробірці надпісатьфамілію, ініціали та групу крові особи, від якого взята кровь.Обично після згортання крові на дні пробірки остаетсянебольшое кількість вільних еритроцитів, які следуетупотреблять для дослідження. Якщо цих еритроцитів недостатньо, слід струснути згорток для відділення більшого колічестваерітроцітов.Допустімо зберігати кров протягом 2-3 діб при температурі + 4-8ш С.Можно брати кров з фізіологічним розчином лімоннокіслогонатрія або іншого стабілізатора (0,25 мл на 1 мл крові) . У етомслучае еритроцити необхідно відмити, для чого в пробірку долітьдоверху ізотонічний розчин NaCl, вміст її перемішати іцентріфугіровать. Отмитиеерітроцітиіспользоватьдляісследованія.Непосредственно перед дослідженням кров може бути взята Ізместьев уколу пальця скляною паличкою і негайно поміщена впробірку з заздалегідь введеної сироваткою антирезус, змішаною сжелатіном 1: 2.в) Техніка визначення. У штатив встановлюють два рядапробірок за кількістю досліджуваних зразків еритроцитів в кожному ряду іподве пробірки для стандартних резус-позитивних ірезус-негативних еритроцитів. На кожних двох пробіркахнадпісивают прізвище та ініціали особи, кров якого будетісследоваться. Пробірки нумерують. У однаково обозначенниепробіркі (в два ряди) вводять по 1 краплі (0,05 мл) ісследуемихерітроцітов, а в контрольні - по одній краплі (0,05 мл) стандартних Rh + і rh- ерітроцітов.Во все пробірки першого ряду додають по одній краплі ( 0,05 мл) сироватки антірезус.Во все пробірки (в два ряди) додають по дві краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину, попередньо підігрітого до разжіженія.Второй ряд є контролем для виключення возможногонеспеціфіческого склеіваніяісследуемих еритроцитів (прямаяжелатіновая проба) .Содержімое пробірок перемішують струшуванням і штатив спробіркамі поміщають у водяну баню при 46-48ш С на 15 хвилин або всуховоздушний термостат на 25-30 хвилин.При витяганні пробірок з водяної бані або термостатадолівают в них 5-8 мл ізотонічного розчину NaCl і перемешіваютсодержімое шляхом 1-2 -кратного перевертання пробірок.г) Трактування результатів. Пробірки переглядають на светневооруженним оком або через лупу.Результат трактують по наявності або відсутності агглютінацііерітроцітов.Прі позитивному результаті агглютінати легко помітні у вигляді червоних грудочок в прозорій, майже прозорої жідкості.Прі негативному результаті в пробірці видно равномерноокрашенная в світло-червоний колір, опалесцирующая жідкость.Образци еритроцитів, що дали аглютинацію з сироваткою анти-D, є резус-позитивними (Rh +). Зразки еритроцитів, Неда аглютинації з сироваткою анти-D, - резус-негативними (rh-). Однак результати враховують як справжні після проверкіконтрольних зразків, які підтверджують специфічність і актівностьсивороткі антирезус, тобто при відсутності аглютинації состандартнимі резус-негативними еритроцитами однойменної группиі наявності аглютинації зі стандартними резус-положітельниміерітроцітамі однойменної групи або групи О (I). У пробіркахвторого (контрольного) ряду аглютинації бути не должно.Налічіе аглютинації в будь-якої пробірці контрольного ряду (пряма желатиновая проба позитивна) говорить про неспеціфічностіреакціі. При цих умовах позитивний результат з сивороткойантірезус не може бути врахований як істинний. У таких случаяхрекомендуется відмити досліджувані еритроцити теплим ізотоніческімраствором NaCl для елюювання з них аутоантитіл і повторітьісследованіе. Прісомнітельном результаті для определеніярезус-приналежності слід застосувати метод аглютинації всолевой середовищі з використанням сироваток антирезус, содержащіхполние антітела.2. Визначення резус-належності за допомогою стандартногоуніверсального реагенту (в пробірках без підігріву) .Спеціальна оснащеніе.стандартний універсальний реагент антирезус - анти-D-33% розчин поліглюкіну-стандартні еритроцити Rh + і rh- для контролю-центрифужні або інші пробірки місткістю 10 мл-лупа з 2-4-кратним увеліченіем.Предварітельная обробка досліджуваної крові не требуется.Может бути використана кров, взята безпосередньо передісследованіем з місця уколу пальця, консервована кров іосадок еритроцитів в пробірці, після утворення згустка крові, взятої без стабілізатора.Допустімо зберігати кров протягом 2 -3 доби при 4-8ш С.Техніка реакціі.В штатив встановлюють два ряди пробірок за кількістю ісследуемихобразцов еритроцитів в кожному ряду і по дві пробірки длястандартних резус-позитивних і резус-негативних ерітроцітов.На пробірках підписують прізвище та ініціали особи, кров которогоісследуется. у всі пробірки першого ряду вводять по 2 краплі (0,1 мл) стандартного універсального реагенту антірезус.Во все пробірки другого (контрольного) ряду вводять по 2 краплі (0,1 мл) ізотонічного розчину NaCl і по 1 краплі (0,05 мл ) 33% розчину поліглюкіна.В кожну пару однаково позначених пробірок вводять согласномаркіровке по 1 краплі (0,05 мл) досліджуваної крові. У пробірки, призначені для контролю, вводять стандартниерезус-позитивні і резус-негативні ерітроціти.Содержімое пробірок перемішують струшуванням і затеммедленно повертають по осі, нахиляючи майже до горізонтальногоположенія так, щоб вміст розтікався по її стінках. Такоерастеканіе крові по стінках пробірок робить реакцію болеевираженной. Як правило, аглютинація настає вже в теченіепервой хвилини, але для утворення стійкого комплексаантіген-антитіло і чітко вираженої реакції, а також в відувозможності замедленнойреакцііпріслабовираженнойагглютінабельності еритроцитів, контакт еритроцитів з реагентомпрі поворачивании пробірок проводять не менше 3 мін.Через 3 хвилини в пробірки додають по 2 3 мл ізотоніческого0,85% розчину NaCl і перемішують вміст 2-3-кратнимперевертиваніем пробірок, які не встряхівая.Трактовка результатов.Пробіркі переглядають на світло неозброєним оком або черезлупу. Результат трактують по наявності або відсутності агглютінацііерітроцітов.Прі наявності аглютинації у вигляді великих грудочок або хлопьевіз склееннихерітроцітов на тлі просвітленої жідкостіісследуемую кров вважають резус-позитивної (Rh +). Привідсутності аглютинації (в пробірці зберігається гомогенноеокрашіваніе) досліджувану кров можна вважати резус-негативною (rh-) . Однак ці результати слід враховувати як справжні толькопосле перевірки контрольних зразків, тобто при положітельнойреакціі состандартнимірезус-позитивними еритроцитами, негативною - з резус-негативними, а також після просмотрарезультатов у 2-му контрольному ряду.Во всіх пробірках 2-го контрольного ряду аглютинації бути недолжно.Налічіе аглютинації в будь-якої пробірці контрольного рядауказивает нанеспеціфіческоесклеіваніеерітроцітові, отже, не дозволяє врахувати результат дослідження какістінний.В цьому випадку рекомендується відмити досліджувані ерітроцітитеплим фізіологічним розчином NaCl для елюювання з ніхаутоантітел і повторити ісследованіе.В сумнівних випадках для визначення резус-прінадлежностіследует застосувати метод аглютинації в сольовому середовищі, іспользуясиворотку з повними антітеламі.3. Визначення резус-належності реакцією конглютинації всивороточной середовищі на площині з подогревом.Спеціальное оснащення: стандартні сироватки антирезус анти-D з неповними антитілами-стандартні еритроцити Rh + і rh- для контролю-пластмасові пластини-водяна баня 46-48ш С.Предварітельная обробка досліджуваної крові і стандартнихерітроцітов.Кровь для дослідження беруть в кількості 3-5 мл в обичниепробіркі без стабілізатора. На пробірці підписують прізвище, ініціали та групу крові особи, від якого береться кров. Обичнопосле згортання крові на дні пробірки залишається небольшоеколічество еритроцитів, які слід вживати для реакціі.Еслі цих еритроцитів недостатньо, слід інтенсивно встряхнутьсверток для відділення більшої кількості ерітроцітов.Ерітроціти використовують для дослідження у вигляді 5-10% суспензії ввласність сироватці. Суспензія готують на око в цих же пробіркахпутем струшування содержімого.Допустімо зберігати кров протягом 2-3 діб при 4-8ш С.Техніка определенія.На пластмасову пластину у позначень наносять по 1 большойкапле (0,1 мл) сироватки антирезус в три ряди по горизонталі, всього в 6 точок (3 - однієї серії сироваток і 3 - інший). Крімтого, в одну точку наносять велику краплю (0,1 мл) стандартнойсивороткі групи АВ (IV), що не містить резус-антитіл (контроль нанеспеціфіческую агглютинацию) .До першої краплі кожної серії сироватки додають одну краплю (0,05 мл) суспензії досліджуваних еритроцитів , до другої краплі каждойсеріі - 1 краплю (0,05 мл) контрольних резус-позитивних, однойменних з групою крові хворого або групи О (I), і до третьейкапле каждойсеріі1каплю (0,05 мл) контрольнихрезус-негативних еритроцитів, обов`язково однойменних з группойкрові хворого за системою АВО. До контрольної краплю з сивороткойгруппи АВ (IV), що не містить резус-антитіл, додають 1 краплю (0,05 мл) досліджуваних еритроцитів. Краплі перемішують стекляннойпалочкой і пластину опускають у водяну баню при 46-48ш С на 10мінут.Трактовка результатов.Результати досліджень переглядають при легкому покачіванііпластіни і трактують по наявності або відсутності агглютінацііерітроцітов.Прі позитивному результаті агглютінати легко помітні напочті знебарвлену тлі жідкості.Прі негативному результаті крапля залишається равномерноокрашенной в червоний цвет.Образци еритроцитів, що дали аглютинацію з сироваткою анти-D, є резус-позитивними (Rh +). Зразки еритроцитів, що не дали аглютинацію з сивороткойанті-D, являютсярезус-негативними (rh-). Однак етірезультати враховують як справжні тільки при збігу їх в обеіхсеріях сироватки антирезус і після перевірки контрольних образцоверітроцітов, що підтверджують специфічність і активність сивороткіантірезус, тобто при відсутності аглютинації зі стандартнимірезус-негативними еритроцитами однойменної групи і налічііагглютінаціі зі стандартними резус-позитивними ерітроцітаміодноіменной групи або групи О (I), а також при отріцательномрезультате в контрольній краплі з сироваткою групи АВ (IV), несодержащей резус-антитіл. Наявність аглютинації в цій каплеговоріт про неспецифічний склеюванні еритроцитів і, отже, позитивний результат з сироваткою антирезус не може бути учтенкак істинний. У цих випадках резус-приналежність следуетопределять, застосовуючи інші методи ісследованія.4. Визначення резус-належності реакціейагглютінаціі в сольовий средеСпеціальное оснащеніе.стандартние сироватки антирезус анти-D з повними антитілами-стандартні еритроцити Rh + і rh- для контролю-пробірки висотою 1,5-2,0 см і діаметром 0,5-0,6 см з гладкімдном округлої форми або планшети для імунологічних реакцій суглубленіямі такий же конфігурації і обсягу-лупа з 2-4-кратним збільшенням-термостат 37ш С.Предварітельная обробка досліджуваної крові і стандартнихерітроцітов.Кровь для дослідження беруть в кількості 0,5-1 мл в обичниепробіркі, містять 0,25 мл (5 крапель) ізотонічного растворалімоннокіслого натрію або іншого стабілізатора. На пробіркенадпісивают прізвище, ініціали та групу крові особи, від котороговзята кров. Еритроцити необхідно відмити, для чого в пробіркідолівают доверху ізотонічний розчин NaCl, вміст іхперемешівают і центріфугіруют.Можно брати кров без стабілізатора. При цьому послесвертиванія крові зазвичай в пробірці залишається деякий колічествосвободних еритроцитів. Якщо цих еритроцитів недостатньо, следуетінтенсівно струсити згорток для відділення більшого колічестваерітроцітов. Отримані таким чином еритроцити відмивають, каксказано више.Із відмитих еритроцитів готують 2% суспензія, для чого 1каплю ерітроцітовпереносят в відповідно обозначеннуюпробірку, що містить 49 крапель ізотонічного розчину NaCl.2% суспензія еритроцитів вживають для ісследованія.Допустімо зберігати кров протягом 2-3 діб при 4-8ш С.Техніка определенія.В штатив встановлюють два ряди пробірок за кількістю ісследуемихобразцов еритроцитів в кожному ряду і дві - для контролей.Предварітельно штатив накривають аркушем паперу. На ньому слегканакаливают отвори, крізь які і встановлюють пробіркі.Протів кожної пари пробірок на папері підписують прізвище іініціали особи, кров якого буде ісследоваться.Во все пробірки (лунка планшета) першого ряду вводять по 1капле (0,05 мл) сироватки антирезус однієї серії, в усі пробірки (лунки) другого ряду - по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антірезусдругой серіїі в усі пробірки (лунки) обох рядів по 1 каплеізотоніческого розчину NaCl.В відповідно позначені пари пробірок (лунок планшета) додають по одній краплі (0 , 05 мл) 2% суспензії іспитуемихерітроцітов, а в контрольні - по одній краплі (0,05 мл) 2% взвесіконтрольних (стандартних) резус-позитивних ірезус-негативних ерітроцітов.Содержімое ретельно перемішують струшуванням і поміщають втермостат при 37ш С на 1 годину. Можна потім залишити пробірки Яка ж при кімнатній температурі ще на 1,5-2 години до учетарезультата.За цей час еритроцити осідають на дно, попередньо войдяв контакт з сироваткою антірезус.Трактовка результатов.Пробіркі (планшети) слід розглядати по поздовжній осінад джерелом світла, закритим матовим стеклом.Результат трактують по наявності або відсутності агглютінацііерітроцітов, що виражається в різній формі їх осаду на дне.Прі позитивному результаті осад еритроцитів располагаетсяна дні нерівномірним шаром. Видно шорсткість, губчастого ілізерністость його структури. Краї осаду ніколи не бувають рівними, вони зігнуті, іноді загорнуті всередину. У деяких случаяхерітроціти розташовуються у вигляді хвилястого віночка навколо болеесветлой центральної часті.Прі негативному результаті осад еритроцитів располагаетсяравномерним шаром без шорсткостей і нерівностей, іноді з невеликим просвітленням в центрі. Межі його представляють собойправільно окреслений круг.Діаметр осаду при негативному результаті завжди менше, ніж при положітельном.Образци еритроцитів, що дали аглютинацію з сироваткою анти-D, є резус-позитивними (Rh +), зразки еритроцитів, Неда аглютинації з сироваткою анти-D, - резус-негативними (rh -). Однак результати враховують як справжні при збігу їх вобе серіях сироватки антирезус і після перевірки контрольнихобразцов, що підтверджують специфічність і активність сивороткіантірезус, тобто при відсутності аглютинації зі стандартнимірезус-негативними еритроцитами однойменної групи і налічііагглютінаціі зі стандартними резус-позитивними ерітроцітаміодноіменной групи або групи О (I) .Прімечаніе. Повні антитіла не виявляють слабкий антиген Du.Повторное використання сивороткі.Послеопределеніярезус-приналежності з усіх пробірок обережно отсасиваютсиворотку (еритроцити залишаються на дні) і збирають її в пробірку.Ету сироватку можна повторно кілька разів застосовувати дляопределения резус-приналежності, поки активність її не вичерпається, тобто поки вона буде давати чітку аглютинацію зі стандартнимірезус-позитивними еритроцитами і негативну реакцію - состандартнимі резус-негативними ерітроцітамі.IV. ЗАГАЛЬНІ ПРІМЕЧАНІЯ1. При визначенні резус-приналежності незалежно від методаопределенія результат враховується як істинний після проверкіконтрольних зразків, які підтверджують специфічність і актівностькаждой серії сироватки антирезус, тобто при отсутствии агглютинациисо стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименнойгруппы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительнымиэритроцитами одноименной группы или группы О(I) и в другихконтрольных пробах, применяемых для каждого метода.2. Если при определении резус-принадлежности наблюдаетсяслабая или сомнительная реакция, то следует повторно исследоватькровь данного лица другими сериями сывороток антирезус и другимиметодами, включая метод агглютинации в солевой среде ссыворотками, содержащими полные антитела.Если при этом все серии сывороток, содержащих неполныеантитела, дадут также слабую или сомнительную реакцию, а с полнымиантителами реакция будет отрицательная, это значит, что эритроцитысодержат слабую разновидность антигена резус, так называемыйантиген Du, частота которого около 1%. В этих случаяхрезус-принадлежность крови больного или беременной женщиныуказывают как резус-отрицательную (rh-), а резус-принадлежностькрови донора как резус-положительную (Rh+), не допуская такимобразом, переливания его крови резус-отрицательным реципиентам.V. ИССЛЕДОВАНИЕ ДРУГИХ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕЗУСПри использовании сывороток, содержащих антитела анти-С,анти-Е, анти-с, анти-е, анти-Сw в чистом виде, а также в сочетаниис анти-D, например D+C- D+E- D+C+E, применяются те же методы, чтои при использовании сыворотки антирезус анти-D. При этомучитывается форма антител.В качестве контролей используют эритроциты, содержащие и несодержащие соответствующий антиген."Інструкцію по визначенню резус-прінадлежностікрові", Затверджену Міністерством охорони здоров`я СРСР 07 вересня 1990 року N 05-14 / 29, вважати такою, що втратила силу з моменту утвержденіяданной інструкціі.Начальнік Управленіяорганізаціі медіцінскойпомощі населеніюМінздрава РФА.І.ВЯЛКОВПріложеніе N 8УТВЕРЖДЕНОПріказ МОЗ Россііот 09.01.1998 р N 2ІНСТРУКЦІЯПО ВИЗНАЧЕННЯ резус-ПРИЛАДДЯ кровину ПЛОЩИНІ БЕЗ ПІДІГРІВУ і ПО ІЗГОТОВЛЕНІЮСТАНДАРТНОЙ СИРОВАТКИ та реактивів антирезус, призначених для ЦІЄЇ ЦЕЛІОбщіе сведеніяМетоди визначення резус-приналежності на площині безподогрева дозволяють швидко проводити дослідження без прімененіяособого лабораторного обладнання безпосередньо у постелібольного, а також у донорів як в одиничних випадках, так і прімассових обследованіях.Методи засновані на використанні сиворотокантірезус, виготовлених в поєднанні з колоїдними розчинами (альбумін, поліглюкін), в присутності яких неповні резус-антітелапріобретают здатність агглютініроватьрезус-положітельниеерітроціти на площині при кімнатній температурі, аналогічнореакціі за визначенням груп крові АВО.Наіболее зручними для практики є методи визначення наплоскості без підігріву при допомоги сироватки антирезус, виготовленої в поєднанні з альбуміном і за допомогою реактіваантірезус, виготовленого з сироватки антирезус в поєднанні ссухім поліглюкін і альбуміном.1. Визначення резус-належності на плоскостібез підігріву за допомогою сироватки антирезус, приготовленої з альбуміном (додається при видачі сироватки) Оснащення: а) спеціально приготована універсальна сироватка антірезусанті-D в комплекті з контрольною сироваткою-б) біла пластинка із змочуваною поверхнею-в) ізотонічний розчин NaCl-г) скляні палочкі.Для дослідження використовують кров, отриману непосредственноіз місця уколу пальця або взяту заздалегідь в пробірку состабілізатором, але не більше 2 діб зберігання при 4-8ш С.Техніка реакціі.На платівці підписують прізвище та ініціали особи, кровькоторого досліджується, і, зробивши відповідні позначення, наносять на неї в дві точки: зліва по 2 краплі сироватки антирезус виправити по 2 краплі контрольної сироватки. Поруч з цими каплямінаносят по 1 краплі досліджуваної крові. Кров ретельно змішують ссивороткой скляною паличкою і розмазують на платівці дополученний тонкого шару. Потім пластинку періодично похитують напротязі 4-5 хвилин і додають в обидві суміші по 1 каплеізотоніческого розчину NaCl для зняття можливої неспеціфіческойагглютінаціі. Спостереження за ходом реакції продовжують до істеченія5 хвилин, після чого враховують результат.Трактовка результату.Якщо зліва, тобто з сироваткою антирезус, проізошлаагглютінація еритроцитів, а праворуч (контроль) її немає - кровьостается рівномірно пофарбованої, без ознак аглютинації, Цеозначає, що досліджувана кров резус-позитивна (Rh +). Якщо в обох краплях аглютинація відсутня, це означає, чтоісследуемая кров резус-негативна (rh -). при наявності аглютинації в контрольній краплі, що можетпроізойті при деяких захворюваннях, наприклад, засчетаутоантітел, необхідно досліджувати кров повторно другіміметодамі, бажано в лабораторних условіях.2. Визначення резус-належності при помощіреактіва антирезус, виготовленого з іспользованіемсухого поліглюкіну (додається при видачі реактиву) Оснащення: а) спеціально приготовлений реактив антирезус анти-D вкомплекте з контрольним реактивом-б) біла пластинка із змочуваною поверхнею-в) ізотонічний розчин NaCl-г) скляні палочкі.Для дослідження використовують кров, отриману непосредственноіз місця уколу пальця або взяту заздалегідь в пробірку состабілізатором не більше, ніж за 2 доби до дослідження. Кровьхранят при 4-8ш С.Техніка реакціі.На платівці підписують прізвище та ініціали особи, кровькоторого досліджується, і, зробивши відповідні позначення, наносять на неї зліва 1 краплю реактиву антирезус і праворуч - 1 каплюконтрольного реактиву, потім додають і до реактиву антирезус, і кконтрольному реактиву по 1 краплі густої суспензії досліджуваної крові.Кровь ретельно змішують з реактивом і розмазують попластінке скляною паличкою тонким шаром. Потім пластінкуперіодіческі похитують протягом 3-4 хвилин і додають в обесмесі для виключення неспецифічної аглютинації по 5-8 капельізотоніческого розчину NaCl.Наблюденіе за ходом реакції продовжують до закінчення 5 хвилин, після чого враховують результат.Трактовка результату.Якщо зліва, тобто з реактивом антирезус, проізошлаагглютінація еритроцитів, а праворуч (в контролі) її немає - Цеозначає, що досліджувана кров резус-позитивна (Rh +). Якщо в обох краплях аглютинація відсутня, це означає, чтоісследуемая кров резус-негативна (rh -). Однак результат враховують як істинний тільки при отсутствііагглютінаціі в контроле.Прі наявності аглютинації в контролі, що може статися прінекоторих захворюваннях, наприклад, за рахунок аутоантитіл, кровьнеобходімо досліджувати повторно іншими методами, бажано влабораторних условіях.3. Виготовлення універсальної сироватки антирезус анти-Dв поєднанні з альбуміном для визначення резус-прінадлежностіна площині без подогреваСиворотка антирезус містить неповні антитіла анти-D.Випускается в комплекті з контрольною сироваткою, що не содержащейрезус-антитіл. Сироватка призначена для определеніярезус-антигену D.Матеріалом для виготовлення сироватки антирезус в поєднанні сальбуміном служить сироватка крові людей групи АВ (IV) іліспеціально приготована - універсальна з титром неполнихрезус-антитіл анти-D не нижче 1:64 - 1: 128 в непрямій пробі Кумбса .Сиворотка повинна бути попередньо досліджена і прізнанагодной, як стандартна сироватка антирезус відповідно до"Інструкцією по виготовленню стандартних сироваток і реагентаантірезус".Матеріалом Для виготовлення контрольної сироватки служітсиворотка крові людей групи АВ (IV), тобто яка не містить какрезус-антитіл, так і групових агглютінінов альфа і бета.Контрольная сироватка повинна відповідати вимогам, що пред`являються до стандартних ізогемагглютінірующіх сивороткамсістеми АВО.Прі виготовленні сироваток антирезус в поєднанні з альбуміномнеобходіми: - альбумін 20-30% розчин, отриманий з плазми кровічеловека-- зразки резус-позитивної і резус-негативної крові, взятої на гепаріне-- гепарін-- ізотонічний розчин NaCl.Работу з виготовлення сироватки починають сподбораоптімального співвідношення сироватки антирезус і альбуміну. Подборможно вести двома способами: а) використовуючи одну і ту ж сироватку антирезус, відчуваючи з нейразние зразки (серії) альбуміну, і вибираючи таким чином образецальбуміна з високою конглютінаціонной активністю-б) використовуючи один і той же зразок (серію) альбуміну, відчуваючи його з різними зразками сироватки антірезус.Вибор альбуміну з високою конглютінаціонной актівностью.Сиворотку антирезус з титром неповних антитіл 1:64 - 1: 128разводят в пробірках в 2-4 рази окремо різними образцаміраствора альбуміна.Разние суміші сироватки антирезус з альбуміном досліджують напластінке з 5-6 зразками (Rh +) і з 5-6 зразками крові ccddee, атакож з кров`ю фенотипу Ccddee і ccddEe.Сиворотку антирезус, змішану з альбуміном, переносять в 2точкі по 2 краплі (0,1 мл) на платівку, додають до неї по 1 краплі (0 , 05 мл) резус-позитивної і резус-негативної крові. Капліперемешівают і розмазують по платівці до отримання тонкого слоя.Наблюденіе ведуть до закінчення 5 хвилин при погойдуванні пластінкі.Учет і оцінка результата.Результат враховують по швидкості настання і велічінеагглютінатов резус-положітельнихерітроцітовіотсутствііагглютінаціі з резус-негативними еритроцитами. На основанііетого відбирають зразки альбуміну найбільш прігодниедляіспользованія.Для подальшого використання застосовують зразки альбуміну, при випробуванні яких аглютинація резус-позитивних ерітроцітовпоявляется протягом перших 20-30 секунд, а неспеціфіческаяаггрегація резус-отріцательнихерітроцітовотсутствуетдоістеченія 10 мінут.Подбор сироватки антирезус з високою конглютінаціоннойактівностью в альбумінової средеНесколько різних зразків сироватки антирезус наносятотдельно в 2 точки по 1 краплі (0,05 мл) на платівку і додають кнім по краплині (0,05 мл) 20-30% альбуміна.Сиворотку ретельно змішують з альбуміном і додають до нейпо 1 краплі (0,05 мл ) резус-позитивної і резус-отріцательнойкрові. Краплі перемішують з еритроцитами на площині до полученіятонкого шару. Спостереження ведуть до 5 хвилин при покачіванііпластінкі.Так надходять окремо для кожного випробуваного образцасивороткі, відчуваючи їх з 5-6 зразками Rh + крові і з 5-6образцамі ccddee, а також з кров`ю фенотипу Сcddee і ccddEe.Учет і оцінка результата.Результат враховують по швидкості настання аглютинації і еевираженності з резус-позитивними еритроцитами і по отсутствіюс резус-негативними еритроцитами ccddee і еритроцитами генотіпаCcddee і ccddEe.Для подальшого використання вибирають сироватки антірезусанті-D, при випробуванні яких чітко виражена агглютінаціярезус-позитивних еритроцитів настає протягом перших 20-30секунд, анеспеціфіческаяагглютінація резус-отріцательнихерітроцітов і еритроцитів фенотипу ccddee і ccddEe відсутня доістеченія 10 мінут.Подбор оптімальногосоотношенія сироватки антирезус іальбуміна.После вибору, альбуміну з найбільш високою конглютінірующейспособностью або, навпаки, вибору сироватки антирезус з високойагглютінірующей активністю в альбумінової середовищі, приступають кподбору оптимального їх співвідношення, для чого : в штатив встановлюють 5 пронумерованих пробірок-в першу пробірку вносять 2 краплі (0,1 мл) обраної серііальбуміна, в другу пробірку - 4 краплі, в третю - 6, в четвертую- 8 і в п`яту - 10 крапель-в кожну пробірку додають по 2 краплі (0,1 мл) сивороткіантірезус і вміст ретельно перемішують-з кожної пробірки переносять в 2 точки по 1 краплі (0,05 мл) напластінку, утворюючи таким чином 2 ряди сироватки з альбуміном-в усі краплі 1-го ряду вносять по 1 краплі (0,05 мл) свежейрезус-позитивної крові, в 2-ій ряд - резус-негативної крові (кров попередньо беруть з гепарином - 1 крапля на 10 мл крові) .Смесь перемішують і спостерігають протягом 3 хвилин пріпокачіваніі пластинки .Учет і оцінка результатов.Четкая аглютинація Rh + еритроцитів і відсутність агглютінацііrh- еритроцитів ccddee і еритроцитів фенотипу Ccddee і ccddEeуказивает на оптимальне співвідношення даного зразка сивороткіантірезус і альбуміна.Пріготовленіе основного обсягу (серії) сироватки антірезусанті-D в поєднанні з альбуміномДля приготування повного обсягу (серії ) стандартної сивороткііспользуют вибранниеоптімальниесоотношенія сироватки іальбуміна. І сироватку і альбумін використовують тих же серій, коториепріменялісь для встановлення оптимального їх соотношенія.К виготовленому повного об`єму суміші сироватки з альбуміномдобавляют гепарин з розрахунку - 1 крапля на 20 мл сивороткі.Пріготовленную таким чином сироватку перевіряють на пластінкахс 5-6 зразками резус-позитивних еритроцитів і з 5-6 образцамірезус-негативних ccddee, а також з еритроцитами фенотипу Сcddeeі ccddEe.Прі наявності чітко вираженої аглютинації срезус-позитивною кров`ю, що наступає через 30-40 сек, іотріцательной реакції з резус-негативною кров`ю ccddee і кровьюфенотіпа ccddee і ccddEe, сироватку антирезус в поєднанні сальбуміном вважають придатною в якості стандартної сивороткіанті-D для визначення резус-приналежності на площині безподогрева.Ісследованіе проводять з одночасним параллельниміспользованіем контрольної сивороткі.Ізготовленіе контрольної сивороткі.Для виготовлення контрольної сироватки іспользуютізогемагглютінірующую сироватку групи АВ (IV) і додають до нейальбумін того ж зразка (серії) і в тій же кількості і співвідношенні, які були використані для приготування даннойсеріі сироватки антірезус.Контрольную сироватку відчувають аналогічно тому, як опісановише для сироватки антирезус. Контрольна сироватка не должнавизивать агглютинацию ерітроцітов.Консервірованіе сивороткі.Сиворотку антирезус і контрольну сироватку консервіруютборной кислотою з розрахунку 2 м на 100 мл сивороткі.Розлів і паспортизація сироватки антирезус іконтрольной сивороткіСиворотку антирезус розливають по 1-2 мл в ампули, коториезапаівают, або у флакони, які щільно закупорюють резіновиміпробкамі. На ампули, флакони наклеюють етикетки з указаніемучрежденія, який виготовив сироватку, специфічності сироватки, методу, для якого вона призначена, кількості, номери серіїі терміну годності.Контрольную сироватку розливають, в таких же обсягах і в тому жеколічестве ампул (флаконів) та так само наклеюють етикетки . Номерсеріі контрольної сироватки повторює номер серії основнойсивороткі антірезус.Храненіе, термін придатності і контроль.Сивороткі антирезус, виготовлені в поєднанні з альбуміном іконтрольние сироватки зберігають при 4-8ш С.Срок придатності - 4 месяца.По закінчення терміну придатності, але при збереженні активності іспеціфічності сироваток , термін придатності може бути продовжений ще на 1месяц.Видача сироватки антірезус.Сиворотка антирезус видається в комплекті з контрольнойсивороткой.К кожного комплекту докладають інструкцію з використання. + ------------------- ------ + + ------------------------- + | Найменування установи-| | Найменування установи-|| виготовлювача | | виготовлювача | + ------------------------- + + -------------------- ----- + | Сироватка антирезус-D | | Контрольна сироватка || для методу на площині | | для методу на площині || без підігріву | | без підігріву || Для всіх груп крові | | Для всіх груп крові || системи АВО | | системи АВО || Серія ______ мл ______ | | Серія ______ мл ______ || Придатна до __________ | | Придатна до __________ | + ------------------------- + + ------------------ ------- + Форми етикеток для сироватки антирезус і контрольнойсивороткі.4. Виготовлення реактиву антирезус з іспользованіемсухого поліглюкіну для визначення резус прінадлежностіна площині без подогреваРеактів містить неповні активні антитіла антирезус анти-D, являє собою в`язкий опалесцентний мутнуватий розчин. Пріхраненіі може випадати осад. Випускається в комплекті сконтрольним реактивом, що не містить резус-антітел.Матеріалом для виготовлення реактиву антирезус служать натівниесивороткі крові людей групи АВ (IV) або спеціально пріготовленние- універсальні з титром неповних резус-антитіл не нижче 1:64 -1: 128 внепрямойпробе Кумбса. Сироватка повинна битьпредварітельно досліджена і визнана придатною, як стандартнаясиворотка антірезус.Матеріалом для виготовлення контрольної сироватки служітсиворотка крові людей групи АВ (IV), тобто яка не містить какрезус-антитіл, так і групових антитіл альфа і бета. Контрольнаясиворотка повинна відповідати вимогам, що пред`являються кстандартним ізогемагглютінірующіх сироваткам системи АВО.Прі виготовленні реактиву антирезус необхідні: - поліглюкін, висушений ліофільним способом-- альбумін-2,5% раствор-- ізотонічний розчин NaCl-- зразки резус-позитивної і резус-негативної крові. Примітки: 1. Полиглюкин висушують ліофільним способом на сублімаціонномаппарате за регламентом, встановленим для сушки плазми. Сушкуведут у флаконах місткістю 250-500 мл.2. 2,5% розчин альбуміну отримують з готового 10% -20% розчину альбуміну шляхом розведення його фізіологічним растворомNaCl.Ізготовленіе реактиву антірезус.Сиворотку, що містить антитіла анти-D з титром не нижче чем1: 64 - 1: 128lt; * gt; переносять у флакон з попередньо висушеннимполіглюкіном в обсязі, що дорівнює кількості рідкого поліглюкіну, висушеного в даному флаконі. В результаті кінцева концентраціяполіглюкіна складе 6% .--------------------------------- lt; * gt; - Примітка: сироватку антирезус з більш високим тітромможно розвести до цього значення сироваткою групи АВ (IV), стандартним разводітелем або 2,5% розчином альбумінавізотоніческом розчині NaCl.Содержімое флакона ретельно перемішують шляхом встряхіваніядо повного розчинення порошку поліглюкіна.Ізготовленіе контрольного реактіва.Для виготовлення контрольного реактиву в інший такий жефлакон з висушеним поліглюкін тієї ж серії добавляютстандартний разводітель або 2,5% розчин альбуміну так само доісходного обсягу поліглюкіну. Вміст ретельно перемішують доповнено розчинення порошку поліглюкіна.Ісследованіе якості виготовлених реактівов.Ісследованіе реактивів виробляють безпосередньо після іхізготовленія срезус-положітельниміі резус-отріцательниміерітроцітамі і оцінюють за характером аглютинації і спеціфічностіреакціі: на платівку поміщають два ряди, зліва - по дві краплі (0,1 мл) реактиву антирезус і праворуч - по дві краплі (0,1 мл) контрольногореактіва-в перший ряд додають по одній краплі (0,05 мл) резус-позитивних еритроцитів, у другий ряд також по однойкапле резус-отріцательнихерітроцітов.Содержімое капельперемешівают, потім розмазують до отримання тонкого шару іоставляют на три хвилини періодично похитуючи платівку-через три хвилини в усі краплі додають по 5-6 капельізотоніческого розчину NaCl, перемішують і через дві мінутиучітивают результат.Реактіви досліджують менеечемс20образцамірезус-позитивних іс30 зразками резус-отріцательнихерітроцітов груп А (II), АВ (IV) і В (III), включаючи ерітроцітиCcddee і ссddEe.Учет і оцінка результатов.Результат враховують по швидкості настання аглютинації і еевираженності з резус-позитивними еритроцитами і відсутністю ЄЕС резус-негативними еритроцитами (ccddee) і ерітроцітаміфенотіпа ccddee і rccddEe.Показателем придатності реактиву для последующегоіспользованія є наявність грубозернистої агглютінаціірезус-позитивних еритроцитів зі швидкістю настання до 1мінути і відсутність її з резус-негативними еритроцитами (ccddee) і еритроцитами фенотипу ccddEe і ссddEe.Контрольний реагент досліджується так само як описано вище дляреагента антирезус. Аглютинація з контрольним реагентом должнаотсутствовать з усіма зразками ерітроцітов.Консервірованіе реактівов.Реактів антирезус і контрольний реактив консервують борнойкіслотой з розрахунку 2 м на 100 мл реагента.Розлів і паспортізація.Реагент антирезус розливають у флакони або ампули. Ампулизапаівают, флакони щільно закупорюють гумовими пробками ізавальцовивают або парафініруют.На ампули, флакони наклеюють етикетки із зазначенням установи, який виготовив реактив, специфічності реактиву, методу для которогоон призначений, кількості, номери серії і терміну годності.Контрольний реактив розливають в таких же обсягах і в тому жеколічестве ампул (флаконів), і також наклеюють етикетки з відповідним текстом. Серійний номер контрольного реактіваповторяет номер серії основного реактиву антирезус. + ------------------------- + + ------------ ------------- + | Найменування установи-| | Найменування установи-|| виготовлювача | | виготовлювача | + ------------------------- + + -------------------- ----- + | Реактив антирезус-D | | Контрольний реактив || для методу на площині | | для методу на площині || без підігріву | | без підігріву || Серія ______ мл ______ | | Серія ______ мл ______ || Годен до __________ | | Годен до __________ | + ------------------------- + + ------------------ ------- + Зберігання, термін придатності і контроль.Реактів антирезус, приготований з сухим поліглюкін іконтрольний реактив зберігають при 4-8ш С. термін придатності 4 месяца.Реактів антирезус і контрольний реактив перевіряють наактівность і специфічність через месяц.Видача реактиву антірезус.Реактів антирезус видається, в комплекті з контрольнимреактівом.К кожного комплекту (або набору комплектів) прідаетсяінструкція по використанню."Інструкцію по визначенню резус-приналежності крові наплоскості без підігріву і з виготовлення стандартної сироватки іреактіва антирезус, призначених для цієї мети", УтвержденнуюМіністерством охорони здоров`я СРСР 06 грудня 1990 року N05-14 / 38-14 вважати такою, що втратила силу з моменту затвердження даннойінструкціі.Начальнік Управленіяорганізаціі медіцінскойпомощі населеніюМінздрава РФА.І.ВЯЛКОВПріложеніе N 9УТВЕРЖДЕНОПріказ МОЗ Россііот 09.01.1998 р N 2ІНСТРУКЦІЯlt; * gt; ЩОДО ВИКОРИСТАННЯ Цоліклони АНТИ-DДІАГНОСТІЧЕСКОГО рідкого ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНІЯD АНТИГЕНУ СИСТЕМИ резус (АнтитілА моноклональних АНТИ-D) ТУ 9398-215-27575295-95) 1. НазначеніеЦоліклон анти-D призначений для виявлення D антигену сістемирезус в еритроцитах людини і застосовується в серологічних тестахвзамен або паралельно з ізоімунної анти-D сивороткой.Порядок встановлення резус-приналежності крові визначено"Інструкцією по определеніюрезус-прінадлежностікрові", Затвердженої Міністерством охорони здоров`я Російської Федерації в1997 році і Методичними рекомендаціями щодо определеніюрезус-приналежності крові, затвердженими ГНЦ РАМН 27 квітня 1994року .-------------------------- ------ lt; * gt; - Укладачі інструкції: професор І.Л.Чертков, діректорТОО "гематолог" Г.Ю.Мітерев, наукові співробітники Л.Н.Леменева, Н.І.Оловнікова, Е.В.Белкіна.2. Характеристика і основні властивості Цоліклони анти-DДействующім початком Цоліклони анти-D є моноклональниеанті-D антитіла, які продукують лімфобластоіаной лінією клетокчеловека, отриманої з лімфоцитів донора, гіперімунні проти Dантігена. Антитіла, які продукують клітинами одного клону, являютсямоноклональнимі, належать до одного класу імуноглобулінів, повністю ідентичні за структурою і біологічною актівності.Поскольку лінія клітин, які секретують моноклональні анти-Dантітела, отримана з лімфоцитів здорового донора, ісключенаконтамінація реагенту патогенними вірусами (гепатит, СНІД і ін. ) .Однак з досліджуваними зразками крові слід працювати в перчаткахво уникнути зараження патогенними вірусами, що передаються черезкровь.Цоліклон анти-D являє собою неразбавленнуюіліразведенную сольовим розчином культуральну рідину, кондиціонованих клітинами-продуцентами антитіл. Анти-Dмоноклональние антитіла належать до імуноглобулінів класу G (IgGl). Цоліклони анти-D не містить антитіл іншої специфічності іпоетому може бути використаний для виявлення D антигену верітроцітах будь-якої групи крові.Анті-D антитіла, що належать до імуноглобулінів класу G (неповні антитіла), не викликають прямої аглютинації еритроцитів, що містять D антиген, і можуть бути використані в реакцііконглютінаціі з желатином, непрямому антіглобуліновой тесті (пробеКумбса), вреакціі аглютинації еритроцитів, обработаннихпротеолітіческімі ферментами, в тому числі в автоматізірованнихсістемах типу "Группоматік".3. Техніка визначення D-антигену системи резусОпределеніе D-антігенапроізводітся в нативної крові, стабілізованої за допомогою застосовуваних консервантов- в крові, взятої без консерванта- в крові, взятої з пальця. Найбільш четкаяреакція аглютинації спостерігається при використанні високойконцентраціі еритроцитів. Висновок про присутність D-антигену вісследуемих еритроцитах роблять за наявністю позитивної реакцііагглютінаціі.3.1. Непрямий антіглобуліновой тест (непряма проба Кумбса) Є найбільш чутливим методом виявлення D антігена.Взвесь (2-3%) в фізіологічному розчині тріждиотмитихісследуемих еритроцитів поміщають в круглодонную пробірку (0,1 млвзвесі еритроцитів) або 96-коміручну круглодонную плату ((0,05 мл / осередок), додають рівний об`єм Цоліклони і інкубують напротязі 45-60 хвилин при 37ш С. Потім після однократного отмиваніяфізіологіческім розчином до осаду еритроцитів додають 0,05-0,1мл антіглобуліновой сироватки, ретельно перемішують і немедленноілі через 15-30 хвилин інкубації при кімнатній температурецентріфугіруют при 200 g протягом 15-20 секунд. Осад мягковзвешівают і за наявністю агглютінати, виявляемихмакро- ілімікроскопіческі, роблять висновок про присутність D антигену вісследуемих ерітроцітах.3.2. Реакція конглютинації з желатіномВ агглютінаціонние пробірку вносять одну краплю (0,05-0,1 мл) вільних еритроцитів з згустку згорнулася кровііліерітроцітов, відмитих від консерванту. Потім додають дві краплі (0,1-0,2 мл) 10% розчину желатину, попередньо прогрітого прі45-50ш С до розрідження, і одну краплю Цоліклони анти-D. Суспензіютщательно перемішують, інкубують 10-15 хвилин на водяній бані ілі30 хвилин в термостаті при 48ш С, додають 5-6 млфізіологіческого розчину і після обережного переворачіваніяпробіркі візуально визначають наявність агглютінати. Агглютінаціяерітроцітов свідчить про присутність в них D антігена.3.3. Реакція з препаратом на основі поліглюкінаПоліглюкін практично всегдавизиваетнеспеціфіческуюагглютінацію D-негативних еритроцитів, тому невозможнооб`ектівное висновок про відсутність D антигену або про наявність егослабого варіанту в досліджуваних еритроцитах. У зв`язку з етіміспользованіе поліглюкіну длямоноклональнихантітелнерекомендуется.3
Поділитися в соц мережах: