Лабораторні методи дослідження. Протеїнурія

Відео: Лабораторні методи досліджень: гематологія

Невеликі кількості білка виявляються в сечі у здорових осіб. Однак такі невеликі концентрації його не вдається виявити за допомогою звичайних методів дослідження. Виділення більш значних кількостей білка, при яких звичайні якісні проби на білок в сечі стають позитивними, називаються протеїнурією. Розрізняють ниркову (справжню) і позанирковим (псевдо) протеїнурію. При нирковій протеїнурії білок в сечу проникає безпосередньо з крові внаслідок збільшення фільтрації його клубочками нирки або зниження канальцевої реабсорбції.

Ниркова (справжня) протеїнурія

Ниркова (справжня) протеїнурія буває функціональної і органічної. Серед функціональної ниркової протеїнурії найбільш часто спостерігаються такі її види:

- фізіологічна протеїнурія новонароджених, яка зникає на 4 10-й день після народження, а у недоношених дещо пізніше;
- ортостатична альбумінурія, яка характерна для дітей у віці 7-18 років і з`являється тільки в вертикальному положенні тіла;
- транзиторна (інсультних) альбумінурія, причиною якої можуть бути різні захворювання органів травлення, важка анемія, опіки, травми або фізіологічні чинники: важке фізичне навантаження, переохолодження, сильні емоції, рясна, багата білком їжа та ін.

Органічна (ниркова) протеїнурія спостерігається внаслідок проходження білка з крові через пошкоджені ділянки ендотелію ниркових клубочків при захворюваннях нирок (гломерулонефрит, нефроз, нефросклероз, амілоїдоз, нефропатія вагітних), розладах ниркової гемодинаміки (ниркова жавна гіпертензія, гіпоксія), трофічних і токсичних (в тому числі лікарських) впливах на стінки капілярів клубочків.

Позанирковим (помилкова) протеїнурія

Позанирковим (помилкова) протеїнурія, при якій джерелом білка в сечі є домішка лейкоцитів, еритроцитів, бактерій, клітин уротелия. спостерігається при урологічних захворюваннях (сечокам`яна хвороба, туберкульоз нирок, пухлини нирки і сечових шляхів та ін.).

Визначення білка в сечі

Більшість якісних і кількісних методів визначення білка в сечі засновані на його коагуляції в обсязі сечі або на межі середовищ (сечі і кислоти).

Серед якісних методів визначення бедки в сечі найбільшого поширення набули уніфікована проба з сульфосалициловой кислотою і кільцева проба Геллера.

Уніфікована проба з сульфасаліціловой кислотою проводиться наступним чином. У 2 пробірки наливають по 3 мл профільтрованої сечі. В одну з них додають 6-8 крапель 20% розчину сульфасаліціловой кислоти. На темному тлі порівнюють обидві пробірки. Помутніння сечі у пробірці з сульфасаліціловой кислотою вказує на наявність білка. Перед дослідженням необхідно визначити реакцію сечі, і якщо вона лужна, то підкислити 2-3 краплями 10% розчину оцтової кислоти.

Проба Геллера заснована на тому, що при наявності білка в сечі на кордоні азотної кислоти і сечі відбувається його коагуляція і з`являється біле кільце. У пробірку наливають 1-2 мл 30% розчину азотної кислоти і обережно по стінці пробірки нашаровуються точно така ж кількість профільтрованої сечі. Поява білого кільця на межі двох рідин вказує на наявність білка в сечі. Слід пам`ятати, що іноді біле кільце утворюється при наявності великої кількості уратів, але на відміну від білкового кільця воно з`являється трохи вище межі між двома рідинами і розчиняється при нагріванні [Плетньова Н.Г., 1987].

З кількісних методів найбільш часто застосовуються:

1) єдиний метод Брандберга-Робертса-Стольнікова, в основу якого покладена кільцева проба Геллера;
2) фотоелектроколоріметріческій метод кількісного визначення білка в сечі по помутніння, що утворюється при додаванні сульфасаліціловой кислоти;
3) біуретова реакція.

Виявлення білка в сечі спрощеним прискореним методом проводять колориметричним методом за допомогою індикаторного паперу, яку випускають фірми «Lachema» (Словаччина), «Albuphan», «Ames» (Англія), «Albustix», «Boehringer» (Німеччина), «Comburtest» та ін. Метод полягає в зануренні в сечу спеціальної паперової смужки, просоченої тетрабромфеноловим синім і цитратним буфером, яка змінює свій колір від жовтого до синього в залежності від вмісту білка в сечі. Орієнтовно концентрацію білка в досліджуваній сечі визначають за допомогою стандартної шкали. Для отримання правильних результатів необхідно дотримуватися таких умов. рН сечі повинна бути в межах 3,0-3,5- при занадто лужної сечі (рН 6,5) буде отримано хибнопозитивний результат, а при занадто кислій сечі (рН 3,0) - псевдонегативну.

Папір повинна знаходитися в контакті з досліджуваної сечею не довше ніж зазначено в інструкції, в іншому випадку тест дасть псевдопозитивну реакцію. Останню також спостерігають і при вмісті в сечі великої кількості слизу. Чутливість різних видів і серій паперу може бути різною, тому до кількісної оцінки білка в сечі цим методом слід ставитися обережно. Визначення його кількості в сечі за допомогою індикаторного паперу неможливо [Плетньова Н.Г., 1987]

Визначення добової протеїнурії

Існує кілька способів визначення кількості білка, що виділився з сечею за добу. Найбільш простим є метод Брандберга -Робертса-Стольнікова.

Методика. 5-10 мл ретельно перемішаної добової сечі наливають у пробірку і обережно по стінках її додають 30% розчин азотної кислоти. При наявності білка в сечі в кількості 0,033% (тобто 33 мг на 1 л сечі) через 2-3 хв з`являється тонке, але чітко видиме біле кільце. При меншій його концентрації проба негативна. При більшому вмісті білка в сечі його кількість визначають шляхом багаторазових розведень сечі дистильованою водою до тих пір, поки не перестане утворюватися кільце. В останній пробірці, в якій ще видно кільце, концентрація білка становитиме 0,033%. Помноживши 0,033 на ступінь розведення сечі, визначають зміст білка в 1 л нерозведеної сечі в грамах. Потім розраховують вміст білка в сечі за формулою:
де К - кількість білка в сечі (г) - х - кількість білка в 1 л сечі (г) - V - кількість сечі, виділене за добу (мл).

У нормі протягом доби з сечею виділяється від 27 до 150 мг (в середньому 40-80 мг) білка.

Зазначена проба дозволяє визначити в сечі тільки дрібнодисперсні білки (альбуміни). Більш точні кількісні методи (колориметричний метод Кьельдаля і ін.) Досить складні і вимагають спеціальної апаратури.

При нирковій протеїнурії з сечею виділяються не тільки альбуміни, а й інші види білка. Нормальна протеінограмма (по Зейц і співавт., 1953) має наступне процентний вміст: альбумінів - 20%, &alpha-₁-глобулінів - 12%, &alpha-₂-глобулінів - 17%, &gamma - глобулінів - 43% і &beta - глобулінів - 8%. Ставлення альбумінів до глобулінів змінюється при різних захворюваннях нирок, тобто порушується кількісне співвідношення між білковими фракціями.

Найбільш поширеними методами фракціонування уропротеінов є наступні: висолювання нейтральними солями, електрофоретичної фракціонування, імунологічні методи (реакція радіальної імунодифузії по Манчіні, іммуноелектрофоретіческій аналіз, преціпітаціонний іммуноелектрофорез), хроматографія, гель-фільтрація, а також ультрацентрифугирование.

У зв`язку з впровадженням методів фракціонування уропротеінов, заснованих на вивченні електрофоретичної рухливості, варіабільності молекулярної маси, розмірів і форми молекул уропротеінов, з`явилася можливість виділяти характерні для того чи іншого захворювання типи протеїнурії, вивчати кліренси індивідуальних плазмових білків. До теперішнього часу в сечі ідентифіковано понад 40 плазмових білків, В тому числі в нормальній сечі 31 плазмовий білок [Berggard, 1970].

селективна протеїнурія

В останні роки з`явилося поняття селективності протеїнурії. У 1955 р Hardwicke і Squire сформулювали поняття «селективна» і «неселективним» протеїнурія, визначивши, що фільтрація плазмових білків в сечу підпорядковується певної закономірності: чим більше молекулярна маса білка, екскретіруемого в сечу, тим менше його кліренс і тим нижче концентрація його в остаточної сечі. Протеїнурія, відповідна цієї закономірності, є селективної на відміну від неселективной, для якої характерним є перекручення виведеної закономірності.

Виявлення в сечі білків з відносно великою молекулярною масою свідчить про відсутність вибірковості ниркового фільтра і вираженому його поразці. У цих випадках говорять про низьку селективності протеїнурії. Тому в даний час широкого поширення набуло визначення білкових фракцій сечі з використанням методів електрофорезу в крохмальної і поліакриламідному гелі. За результатами цих методів дослідження можна судити про селективності протеїнурії.

За даними В.С.Махліной (1975), найбільш виправданим є визначення селективності протеїнурії шляхом порівняння кліренс 6-7 індивідуальних білків плазми крові (альбуміну, транеферріна, &alpha-₂ - макроглобуліну, IgA, IgG, IgM) з використанням точних і специфічних кількісних імунологічних методів реакції радіальної імунодифузії по Манчіні, іммуноелектрофоретіческого аналізу і преціпітального іммуноелектрофореза. Ступінь селективності протеїнурії визначають за індексом селективності, що представляє собою відношення порівнюваного і еталонного білків (альбуміну).

Вивчення кліренс індивідуальних плазмових білків дозволяє отримати достовірні відомості про стан фільтраційних базальних мембран клубочків нирки. Зв`язок між характером екскретіруемих в сечу білків і змінами базальних мембран клубочків настільки виражена і постійна, що по уропротеінограмме можна побічно судити про патофізіологічні зміни в клубочках нирок. У нормі середній розмір пор гломерулярной базальної мембрани складає 2,9-4 А ° НМ, які можуть пропускати білки, що мають молекулярну масу до 10⁴ (Міоглобулін, кислий &alpha-₁ - глікопротеїн, легкі ланцюги імуноглобулінів, Fc і Fab - фрагменти IgG, альбумін і трансферин).

При гломерулонефриті, нефротичному синдромі розміри пір в базальних мембранах клубочків збільшуються, в зв`язку з чим базальнамембрана стає проникною для білкових молекул великого розміру і маси (церулоплазмін, гаптоглобін, IgG, IgA та ін.). При крайньому ступені пошкодження клубочків нирок в сечі з`являються гігантські молекули білків плазми крові (&alpha-₂-макроглобулин, IgM і &beta-₂-липопротеин).

Визначаючи білковий спектр сечі, можна зробити висновок про переважне ураженні тих або інших ділянок нефрона. Для гломерулонефриту з переважним ураженням гломерулярних базальних мембран характерна наявність в сечі крупно-і середньомолекулярних білків. Для пієлонефриту з переважним ураженням базальних мембран канальців характерні відсутність великомолекулярних і наявність підвищених кількостей середньо- і низькомолекулярних білків.

&beta-₂-мікроглобулін

Крім загальновідомих білків, таких як альбумін, імуноглобуліни, ліпопротеїни. фібриноген, трансферин, в сечі містяться плазмові білки-мікропротеїн, серед яких клінічний інтерес представляє &beta-₂-микроглобулин, відкритий Berggard і Bearn в 1968 р Маючи низьку молекулярну масу (відносна молекулярна маса 1800), він вільно проходить через клубочки нирки і майже повністю реабсорбується в проксимальних канальцях. Це дозволяє використовувати кількісне визначення &beta-₂-мікроглобуліну в крові та сечі для визначення клубочкової фільтрації і здатності нирок до резорбції протеїнів в проксимальних канальцях.

Концентрацію цього білка в плазмі крові і сечі визначають радиоиммунологическим методом за допомогою стандартного набору «Phade-bas &beta-₂-mikroiest »(фірма« Pharmaсia », Швеція). У сироватці крові здорових людей міститься в середньому 1,7 мг / л (коливання від 0,6 до 3 мг / л), в сечі - в середньому 81 мкг / л (максимально 250 мкг / л) &beta-₂-мікроглобуліну. Перевищення його в сечі понад 1000 мкг / л - явище патологічне. зміст &beta-₂-мікроглобуліну в крові збільшується при захворюваннях, що супроводжуються порушенням клубочкової фільтрації, зокрема при гострому і хронічному гломерулонефриті, полікістоз нирок, нефросклероз, діабетичної нефропатії, гострої ниркової недостатності.

концентрація &beta-₂-мікроглобуліну в сечі підвищується при захворюваннях, що супроводжуються порушенням реабсорбційну функції канальців, що призводить до збільшення екскреції його з сечею в 10-50 разів, зокрема, при пієлонефриті, хронічній нирковій недостатності, гнійної інтоксикації і ін. Характерно, що при циститі на відміну від пієлонефриту НЕ спостерігається збільшення концентрації &beta-₂-мікроглобуліну в сечі, що може бути використано для диференціальної діагностики цих захворювань. Однак при інтерпретації результатів дослідження треба враховувати, що будь-яке підвищення температури завжди супроводжується збільшенням екскреції &beta-₂-мікроглобуліну з сечею.

Середні молекули крові і сечі

Середні молекули (СМ), інакше звані білковими токсинами, являють собою речовини з молекулярною масою 500-5000 дальтон. Фізична структура їх невідома. До складу СМ входять щонайменше 30 пептидів: окситоцин, вазопресин, ангіотензин, глюкагон, адренокортикотропний гормон (АКТГ) і ін. Надмірне накопичення СМ спостерігається при зниженні функції нирок і змісті в крові великої кількості деформованих білків і їх метаболітів. Вони володіють різноманітним біологічним дією і нейротоксичності, викликають вторинну иммунодепрессию, вторинну анемію, пригнічують біосинтез білка і еритропоез, гальмують активність багатьох ферментів, порушують протягом фаз запального процесу.

Рівень СМ в крові та сечі визначають скринінговим тестом, а також шляхом спектрофотометрії в ультрафіолетовій зоні по довжині хвилі 254 і 280 мм на спектрофотометрі ДІ-8Б, а також динамічної спектрофотометрії з комп`ютерною обробкою в діапазоні хвиль 220-335 нм на тому ж спектрометрі фірми Beckman . За норму приймають вміст СМ в крові, рівне 0,24 ± 0,02 ум. од., а в сечі - 0,312 ± 0,09 ум. од.
Будучи нормальними продуктами життєдіяльності організму, вони видаляються з нього в нормі ночками шляхом гломерулярної фільтрації на 0,5% - 5% їх утилізується іншим шляхом. Всі фракції СМ піддаються канальцевої реабсорбції.

Неплазменние (тканинні) уропротеіни

Крім білків плазми крові, в сечі можуть бути неплазменние (тканинні) протеїни. За даними Buxbaum і Franklin (1970), неплазменние білки складають приблизно 2/3 всіх біоколлоідамі сечі і значну частину уропротеінов при патологічної протеїнурії. Тканинні білки потрапляють в сечу безпосередньо з нирок або органів, анатомічно пов`язаних з сечовими шляхами, або потрапляють з інших органів і тканин в кров, а з неї через базальні мембрани клубочків нирки - в сечу. В останньому випадку екскреція в сечу тканинних протеїнів відбувається аналогічно виведенню плазмових білків різної молекулярної маси. Склад неплазменних уропротеінов надзвичайно різноманітний. Серед них глікопротеїни, гормони, антигени, ферменти (ензими).

Тканинні протеїни в сечі виявляють за допомогою звичайних методів білкової хімії (ультрацентрифугирование, гель-хроматографія, різні варіанти електрофорезу), специфічних реакцій на ферменти і гормони і імунологічних методів. Останні дозволяють також визначити концентрацію неплазменного уропротеіна в сечі і в ряді випадків визначити тканинні структури, що стали джерелом його появи. Основним методом виявлення в сечі неплазменного білка є іммунодіффузіонний аналіз з антисироваткою, отриманої імунізацією експериментальних тварин сечею людини і виснаженою (адсорбированной) в подальшому білками плазми крові.

Дослідження ферментів в крові та сечі

При патологічному процесі спостерігаються глибокі порушення життєдіяльності клітин, що супроводжуються виходом внутрішньоклітинних ферментів в рідинні середовища організму. Ензимодіагностика базується на визначенні ряду ферментів, що виділилися з клітин уражених органів і не властивих сироватці крові.
Дослідження нефрона людини і тварин показали, що в окремих його частинах є висока ферментативна диференціація, тісно пов`язана з функціями, які виконує кожен відділ. В клубочках нирки міститься відносно невелика кількість різних ензимів.

Клітини ниркових канальців, особливо проксимальних відділів, містять максимальну кількість ензимів. Висока їх активність спостерігається в петлі Генле, прямих канальцях і збірних трубочках. Зміни активності окремих ензимів при різних захворюваннях нирок залежать від характеру, гостроти і локалізації процесу. Вони спостерігаються до появи морфологічних змін в нирках. Оскільки зміст різних ферментів чітко локалізовано в нефроне, визначення того чи іншого ферменту в сечі може сприяти топічної діагностики патологічного процесу в нирках (клубочки, канальці, корковий або мозковий шар), диференціальної діагностики ниркових захворювань і визначення динаміки (загасання і загострення) процесу в нирковій паренхімі.

Дли диференціальної діагностики захворювань органів сечостатевої системи застосовують визначення активності в крові і сечі наступних ферментів: лактатдегідрогенази (ЛДГ), лейцінамінопептідази (лап), кислої фосфатази (КФ), лужної фосфатази (ЛФ), &beta - глюкуронідази, глютамін-щавелевоуксусной трансамінази (ГЩТ), альдолази, трансамідіназа і ін. Активність ферментів в сироватці крові і в сечі визначають за допомогою біохімічних, спектрофотометричних, хроматографічних, Флуоріметріческій і хемілюмінесцентних методів.

Ензімурія при захворюваннях нирок більш виражена і закономірна, ніж ензімемія. Вона особливо сильно виражена в гострій стадії захворювання (гострий пієлонефрит, травма, розпад пухлини, інфаркт нирки і т.д.). При цих захворюваннях виявляється висока активність трансамідіназа, ЛДГ, ЛФ і КФ, гіалуронідази, лап, а також таких неспецифічних ензимів, як ГЩТ, каталаза [Полянцева Л.Р., 1972].

Селективна локалізація ферментів в нефроне при виявленні лап і ЛФ в сечі дозволяє з упевненістю говорити про гострих і хронічних захворюваннях нирок (гостра ниркова недостатність, некроз ниркових канальців, хронічний гломерулонефрит) [Шеметов В.Д., 1968]. За даними А.А.Кареліна і Л.Р.Полянцевой (1965), трансамідіназа міститься лише в двох органах - нирці і підшлунковій залозі. Вона є мітохондріальних ферментом нирок і в нормі в крові і сечі відсутній. При різних захворюваннях нирок трансамідіназа з`являється в крові і в сечі, а при ураженні підшлункової залози - тільки в крові.

Диференціальним тестом в діагностиці гломерулонефриту і пієлонефриту Krotkiewski (1963) вважає активність ЛФ в сечі, підвищення якої більш характерно для пієлонефриту і діабетичного гломерулосклероз, ніж для гострого і хронічного нефриту. Наростаюча в динаміці амілаземія при одночасному зниженні амілазуріей може вказувати на нефросклероз і зморщування нирки, лап має найбільше значення при патологічних змінах в клубочках і звивистих канальців нирки, оскільки зміст її в цих відділах нефрона вищу [Шепотіновскій В.П. і ін., 1980]. Для діагностики волчаночного нефриту рекомендується визначення &beta - глюкуронідази і КФ [Приваленко М.Н. і ін., 1974].

При оцінці ролі ензімуріі в діагностиці захворювань нирок слід враховувати наступні положення. Ензими, будучи за своєю природою білками, при малій молекулярній масі можуть проходити через неушкоджені клубочки, визначаючи так звану фізіологічну ензімурію. Серед цих ензимів постійно визначаються в сечі &alpha - амілаза (відносна молекулярна маса 45 ТОВ) і уропепсін (відносна молекулярна маса 38000).

Поряд з низькомолекулярними ензимами в сечі здорових осіб можуть бути виявлені в невеликій концентрації і інші ензими: ЛДГ, аспартат- і аланінамінотрансферази, ЛФ і КФ, мальтаза, альдолаза, ліпаза, різні протеази і пептідази, сульфатаз, каталаза, рибонуклеаза, пероксидаза [King, Воусе, 1963].

Високомолекулярні ензими з відносною молекулярною масою більше 70000-100000, на думку Richterich (1958) і Hess (1962), можуть проникати в сечу лише при порушенні проникності клубочкового фільтра. Нормальний вміст ферментів в сечі не дозволяє виключити патологічний процес в нирці при оклюзії сечоводу. При епзімуріі можливий вихід ензимів не тільки з самих нирок, але і з інших паренхіматозних органів, клітин слизових оболонок сечових шляхів, передміхурової залози, а також формених елементів сечі при гематурії або лейкоцитурии.

Більшість ензимів неспецифічно по відношенню до нирці, тому звідки походять ензими, виявлені в сечі здорових і хворих, встановити важко. Однак ступінь ензімуріі навіть дли неспецифічних ензимів при ураженні нирок буває вище норми або тієї, яка спостерігається при захворюваннях інших органів. Більш цінну інформацію може дати комплексне дослідження в динаміці ряду ферментів, особливо органоспецифічних, таких як трансаминаза.

У вирішенні питання про нирковий походження ензиму в сечі допомагає дослідження ізоензимів з виявленням фракцій, типових для досліджуваного органу. Ізоензими - це ензими, ізогенні за дією (каталізують одну і ту ж реакцію), але гетерогенні за хімічною структурою та іншими властивостями. Кожна тканина має характерний для неї ізоензімних спектр. Цінними методами поділу ізоензимів є електрофорез в крохмальної і поліакриламідному гелі, а також іонообмінна хроматографія.

Білок Бенс-Джонса

При мієломній хворобі і макроглобулінемії Вальденстрема в сечі виявляють білок Бенс-Джонса. Метод виявлення названого білка в сечі заснований на реакції термопреципітації. Застосовувалися раніше методи, за допомогою яких оцінюють розчинення цього білка при температурі 100 ° С і повторне осадження при подальшому охолодженні, ненадійні, так як не всі білкові тіла Бенс-Джонса мають відповідні властивості.

Більш вірогідно виявлення цього парапротеина шляхом осадження його при температурі 40 -60 ° С. Однак і в цих умовах осадження може не відбутися в дуже кислому (рН lt; 3,0-3,5) або занадто лужної (рН gt; 6,5) сечі, при низькій ОПМ і низької концентрації білка Бенс-Джонса. Найбільш сприятливі умови для його осадження забезпечує методика, запропонована Patnem: 4 мл профільтрованої сечі змішують з 1 мл 2 М ацетатного буфера рН 4,9 і зігрівають 15 хв на водяній бані при температурі 56 ° С. При наявності білка Бенс-Джонса протягом перших 2 хв з`являється виражений осад.

При концентрації білка Бенс-Джонса менше 3 г / л проба може бути негативною, але на практиці це зустрічається вкрай рідко, оскільки його концентрація в сечі, як правило, більш значна. На проби з кип`ятінням можна цілком покладатися. З повною достовірністю він може бути виявлений у сечі імуно-електрофоретичних методом з використанням специфічних сироваток проти важких і легких ланцюгів імуноглобулінів.

Н.А. Лопаткін