Основи молекулярної терапії. Генна терапія

Відео: Молекулярні основи індивідуалізації терапії НМРЛ з частими мутаціями

Встановлення локалізації та послідовності гена, мутації якого викликають конкретні захворювання, а також самої мутації і сучасні способи її тестування дозволяють діагностувати захворювання в нео- і навіть пренатальний період розвитку організму. Це дає можливість пом`якшити прояв генетичного дефекту за допомогою медикаментозного лікування, дієти, переливання крові і т.д.

Однак такий підхід не призводить до виправлення самого дефекту і, як правило, спадкові захворювання не виліковуються. Ситуація ускладнюється ще й тим, що мутація одного гена може давати найрізноманітніші наслідки на організм. Якщо мутація гена викликає зміни активності ферменту, який він кодує, то це може привести до накопичення токсичного субстрату або, навпаки, до дефіциту з`єднання, необхідного для нормального функціонування клітини.

Добре відомим прикладом такого захворювання є фенілкетонурія. Його викликає мутація в гені печінкового ферменту фенілаланіндегідроксілази, що каталізує перетворення фенілаланіну в тирозин. В результаті підвищується рівень ендогенного фенілаланіну в крові, що викликає неправильне формування мієлінової оболонки навколо аксонів нервових клітин центральної нервової системи і, як наслідок, важку розумову відсталість.

Якщо мутація зачіпає ген структурного білка, то це може призводити до серйозних порушень на рівні клітин, тканин або органів. Прикладом такого захворювання є кістозний фіброз.

Делеция в гені, що кодує білок, який називається транспортер кістозного фіброзу, призводить до синтезу дефектного білка (відсутність фенілаланіну 508) і порушень транспорту іонів хлору крізь клітинні мембрани. Одним з найбільш шкідливих наслідків цього є те, що слиз, яка вистилає і захищає легені, стає ненормально густий. Це ускладнює доступ до клітин легенів і сприяє накопиченню шкідливих мікроорганізмів. Клітини, що вистилають повітроносні шляхи легких, гинуть і замінюються фіброзною рубцевої тканиною (звідси назва хвороби). В результаті пацієнт гине від порушення дихання.

Спадкові захворювання відрізняються складними клінічними проявами, і їх традіцінно лікування має в основному симптоматичний характер: для лікування фенілкетонурії призначають безаланіновую дієту, дефектні білки замінюють функціональним внутрішньовенним введенням, для компенсації втрачених функцій проводять трансплантацію кісткового мозку або інших органів. Всі ці заходи, як правило, малоефективні, дороги, тривалі, і лише деякі пацієнти доживають до старості. Тому розробка принципово нових видів терапії дуже актуальна.

генна терапія

Генною терапією називається генетична інженерія соматичних клітин людини, спрямована на виправлення генетичного дефекту, що викликає захворювання. Корекція специфічногозахворювання здійснюється шляхом введення в дефектні соматичні клітини нормальних експресуються генів. До 80-их рр., Коли були розроблені методи отримання окремих генів і створені еукаріотичні експресують вектори, стали рутинними експерименти по переносу генів на мишах, перспективи генної корекції стали реальними.

У 1990 р в США доктором У. Френч Андерсоном (W. French Andrson) були зроблена перша спроба генотерапіі для лікування важкого комбінованого імунодефіциту (ТКІД) у трирічної дівчинки Ашанті де Сілва (Ashanthi da Silva). Це захворювання викликається мутацією в гені, що кодує аденозанаденілазу (АДА). Дефіцит цього ферменту сприяє накопиченню в крові аденозину і дезоксіаденозіна, токсична дія яких призводить до загибелі В- і Т-лімфоцитів периферичної крові і, як наслідок, імунодефіциту.

Діти з таким захворюванням повинні бути захищені від будь-яких інфекцій (міститися в спеціальних стерильних камерах), оскільки будь-яка хвороба може виявитися смертельною. Через 4 роки після початку лікування у дитини спостерігалася експресія нормально функціонуючої АДА і полегшення симптомів ТКІД, що дозволило їй покинути стерильну камеру і жити нормальним життям.

Таким чином, була продемонстрована принципова можливість успішної генетичної терапії соматичних клітин. Починаючи з 90-х рр. проходять випробування генної терапії цілого ряду генетичних захворювань, серед яких такі важкі, як гемофілія, СНІД, різні види злоякісних новоутворень, муковісцидоз та ін. На даний момент піддаються лікуванню за допомогою трансгенеза вже близько 10 хвороб людини.

Різноманітність генетичних захворювань зумовило розвиток безлічі підходів генної терапії. При цьому вирішуються 2 головні проблеми: засіб доставки терапевтичного гена- спосіб забезпечення адресної доставки до клітин, призначеним для корекції. До теперішнього часу всі підходи до генної терапії соматичних клітин можна розділити на дві категорії: терапія ex vivo і in vivo (рис. 3.15).


Генна терапія ex vivo припускає генетичне виправлення дефектних клітин поза організмом з наступним поверненням нормально функціонуючих клітин в організм.

Генна терапія in vivo передбачає доставку терапевтичного гена безпосередньо в клітини певної тканини пацієнта. Розглянемо ці підходи докладніше.

Генна терапія ex vivo включає наступні етапи:
1) отримання дефектних клітин хворого і їх культивування;
2) перенесення потрібного гена в ізольовані клітини за допомогою трансфекції терапевтичної генної конструкції;
3) відбір і нарощування генетично виправлених клітин;
4) трансплантація або трансфузія цих клітин пацієнта.

Використання власних клітин пацієнта гарантує, що після їх повернення у нього не розвинеться імунну відповідь. Процедура перенесення генної конструкції повинна бути ефективною, а нормальний ген повинен стабільно підтримуватися і безперервно експресуватися.

Засобом перенесення генів, створеного самою природою, є віруси. З метою отримання ефективних векторів для доставки генів в основному використовують дві групи вірусів - аденовіруси та ретровіруси (рис. 3.16). У генної терапії застосовують варіанти генетично знешкоджених вірусів.


Розглянемо пристрій і використання конструкцій на основі ретро-вірусів. Нагадаємо, що геном ретровірусу представлений двома ідентичними одноланцюжковий молекулами РНК, кожна з яких складається з шести ділянок: два довгих кінцевих повтору (LTR) на 5 `і 3` кінцях, що не кодують послідовність * Р +, необхідна для упаковки РНК у вірусну частку, і три ділянки, що кодують структурний білок внутрішнього капсида (gag), зворотну транскриптазу (pol) і білок оболонки (env) (рис. 3.17, а).


Нагадаємо, що життєвий цикл ретровируса включає наступні стадії:
1. Інфікування клітин-мішені.
2. Синтез ДНК копії геному за допомогою власної зворотної транскриптази.
3. Транспорт вірусної ДНК в ядро.
4. Вбудовування вірусної ДНК в хромосому клітини-господаря.
5. Транскрипція мРНК з вірусною ДНК під контролем сильного промотора, локалізованого на ділянці 5`-LTR.
6. Трансляція білків Gag, Pol і Env.
7. Освіта вірусного капсида і упаковки двох РНК-ланцюгів і молекул зворотної транскриптази.
8. Вивільнення віріонів з клітини.

При отриманні ретровирусного вектора повнорозмірну ДНК ретро-вірусу вбудовують в плазміду, видаляють більшу частину гена gag і повністю гени pol і env, а замість них вбудовують «терапевтичний» ген Т і при необхідності маркерний селективний ген Rg з власним промотором (рис. 3.17, б ). Транскрипція гена Т буде контролюватися все тим же сильним промотором, локалізованим на 5`-LTR ділянці. На основі цієї схеми створені різні ретровірусних вектори і максимальний розмір ДНК-вставки приблизно 8 тис. П.о.

Отриману таким чином конструкцію можна саму по собі використовувати для трансформації, але її ефективність і подальша інтеграція в геном клітини-господаря вкрай низькі. Тому була розроблена методика упаковки повнорозмірною РНК ретровирусного вектора в інтактні вірусні частинки, які з високою частотою проникають в клітку і гарантовано вбудовуються в геном господаря. Для цього була створена так звана «пакує» клітинна лінія. У двох різних ділянках хромосом цих клітин вшиті ретровірусних гени gag і pol-env, позбавлені здатності пакуватися через відсутність послідовності + (84 * +) (рис. 3.18).


Тобто обидва ці фрагмента транскрибируются, але при цьому утворюються позбавлені РНК порожні капсиди. При трансфекції РНК вірусного вектора в такі клітини вона вбудовується в хромосомну ДНК і транскрибується з утворенням повнорозмірною РНК ретровірусу, і в таких умовах в капсид упаковується тільки РНК вектора (тільки в ній є + -послідовність). Утворені інтактні вірусні частинки використовують для ефективної доставки ретровирусного вектора в клітини-мішені.

Ретровіруси активно інфікують лише інтенсивно діляться клітини. Для перенесення генів їх обробляють очищеними частинками упакованого ретровирусного вектора або спільно культивують з виробляє їх клітинної лінією, а потім здійснюють селекцію для поділу клітин-мішеней і пакующіх клітин.

Трансдуцірованние клітини ретельно перевіряють на рівень синтезу продукту терапевтичного гена, відсутність компетентних по реплікації ретровірусів, відсутність змін здатності клітин до зростання або функціонуванню.

Найбільш придатними для проведення генної терапії є клітини кісткового мозку. Це пов`язано з наявністю в ньому тотипотентних ембріональних стовбурових клітин, які можуть пролиферировать і диференціюватися в різні типи клітин -в- і Т-лімфоцити, макрофаги, еритроцити, тромбоцити і остеокласти. Саме ці клітини застосовують для лікування цілого ряду спадкових захворювань, серед них вже згаданий нами важкий комбінований імунодефіцит, хвороба Гоше, серповидноклітинна анемія, таласемія, остеопороз і ін.

Крім тотипотентних стовбурових клітин кісткового мозку, які важко виділяти і культивувати, використовують стовбурові клітини з пупoвінной крові (переважне використання для генотерапіі новонароджених), а також клітини печінки - гепатоцити - для лікування гіперхолестеролемія.

При генної терапії in vivo особливо важливо забезпечити доставку терапевтичного гена до дефектним клітинам. Таку адресну доставку можуть забезпечити модифіковані вектори, створені на основі вірусів, здатних інфікувати специфічні види клітин. Розглянемо підхід, розроблений для лікування вже згаданого вище кістозного фіброзу. Оскільки легені є відкритою порожниною, терапевтичні гени до них доставити відносно легко. Клонований варіант здорового гена був введений в інактивований аденовірус (рис. 3.19). Специфіка цього типу вірусу полягає в тому, що він інфікує вистилання легких, викликаючи застуду.


Сконструйований таким чином вірус відчували, розпорошуючи його в ніс і легені експериментальних тварин, а потім людей-пацієнтів. У деяких випадках спостерігалося введення і експресія здорового гена, і відновлення нормального перенесення іонів хлору. Можливо, цей підхід (введення нормального гена за допомогою носових аерозолів) в найближчому майбутньому буде широко використовуватися для лікування симптомів кістозного фіброзу в легенях.

Крім ретро- і аденовірусів в експериментах з генної терапії використовують і інші типи вірусів, наприклад вірус Herpes simplex. Особливістю цього двунітевой (152 тис. П.о.) ДНК-вірусу є його здатність специфічно вражати нейрони. Відомо безліч генетичних захворювань, що вражають центральну і периферичну нервову систему - пухлини, метаболічні порушення, нейродегенеративні захворювання (хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона).

Вірус простого герпесу I типу (HSV) є досить підходящим вектором для терапії таких захворювань. Капсид цього вірусу зливається з мембраною нейрона, і його ДНК транспортується в ядро. Запропоновано декілька способів перенесення терапевтичного гена за допомогою HSV-векторів і проведені успішні випробування на експериментальних тварин.

Вірусні вектори мають кілька недоліків: висока вартість, обмежена клонуюча ємність і можлива запальна реакція. Так, в 1999 р в результаті розвинувся надзвичайно сильної імунної відповіді на введення аденовірусного вектора загинув 18-річний доброволець, який брав участь у випробуваннях препарату. У 2002 р у двох дітей у Франції під час лікування від імунодефіциту (введенням терапевтичних генів в стовбурові клітини за допомогою ретровірусів) розвинулося стан, схоже на лейкемію.

Тому розробляються невірусні системи доставки генів. Найпростіший і ефективний спосіб - це ін`єкція плазмідної ДНК в тканини. Другий підхід - це бомбардування тканин мікрочастинками золота (1-3 мкм), кон`югованими з ДНК. При цьому терапевтичні гени експресуються в тканинах-мішенях і їх продукти - терапевтичні білки - надходять в кров. Основним недоліком цього підходу є передчасна інактивація або руйнування цих білків компонентами крові.

Доставку ДНК можна здійснити, упакувавши її в штучну липидную оболонку. Отримані таким чином сферичні частинки-ліпосоми легко проникають через клітинну мембрану. Створено ліпосоми з різними властивостями, проте поки ефективність такої доставки невисока, оскільки велика частина ДНК піддається лізосомної руйнування. Також для доставки генетичної конструкції синтезують кон`югати ДНК з різними молекулами, здатними забезпечити її схоронність, адресну доставку і проникнення в клітину.

В останні роки проводяться інтенсивні експерименти зі створення штучної 47-ої хромосоми, яка дозволила б включити велику кількість генетичного матеріалу з повним набором регуляторних елементів для одного або декількох терапевтичних генів. Це дало б можливість використовувати геномної варіант терапевтичного гена і тим самим забезпечити його стабільність і ефективну тривалу експресію. Проведені експерименти показали, що створення штучної хромосоми людини, що містить терапевтичні гени, цілком реально, однак поки незрозуміло, яким чином вводити таку величезну молекулу в ядро клітини-мішені.

Основними проблемами, які стоять перед генною терапією, крім ризику важкої імунної реакції, є труднощі тривалого зберігання і функціонування терапевтичної ДНК в організмі пацієнта, мультігенних багатьох хвороб, що робить їх важким мішенню для генної терапії, а також ризик використання вірусів в якості векторів.

Н.А. Воїнів, Т.Г. Волова