Методи виділення полірібосом. Розміри полірібосом синтезують антитіла

В даний час для виділення полірібосом з лімфоїдних тканин і мієломних пухлин зазвичай використовують гомогенізацію їх в трис-буферних розчинах (рН 7,0-7,6), що містять сахарозу, КСl (або рідше - NaCl), MgCl2 (або ацетат магнію) і який-небудь з інгібіторів РНКази (частіше - гепарин). Необхідною умовою є використання реактивів, що не містять РНКази. З гомогенату спочатку видаляють ядра і мітохондрії, до постмітохондріальній супернатанту додають який-небудь з детергентів (дезоксихолат натрію, або тритон Х-100), що розчиняє мембрани енодоплазматіческого ретикулума, і поліробосоми осаджують (або фракционируют) в ступінчастому (0,5-1,5 М) або лінійному (зазвичай 15-30% -ному) градієнтах сахарози. Вихід полірібосомного матеріалу становить при цьому 30-50% від числа всіх клітинних рибосом.

На ступінь нативної полірібосом, одержуваних з різних джерел, впливають концентрація сахарози, іонна сила і рН буферного розчину, співвідношення K / Mg і природа використовуваного детергента. Так, для отримання полірібосом з селезінки краще використовувати тритон Х-100, так як в присутності дезоксіхолатов натрію відзначалася їх деградація. У деяких випадках рекомендується також додавання невеликих кількостей СаС12, або спермидина, що підвищують стабільність клітинних ядер (Горюнова та ін., 1974 Wall е. А., 1977), і 2-меркаптоетанол (Schechter, 1973). З метою скоротити час контакту полірібосом з клітинним лізатів можна також відразу наносити клітини на містить інгібітор детергент, нашарування прямо на сахарозний градієнт. В цьому випадку при центрифугуванні клеткп одночасно і лизируются, і фракционируют (Davis е. А., 1969).

Необхідно відзначити, що виділення нативних полірібосом з клітин нормальних лімфоїдних тканин або тканин імунізованих тварин є значно складнішою і менш розробленої процедурою, ніж виділення їх з плазмоцидом. Можливо, це пов`язано з тим, що в Плазмоцитома є ендогенний інгібітор РНКази, в той час як в селезінці і лімфовузлах його немає, а активність РНКази при імунізації навіть зростає.

істотну роль, мабуть, грає і вид тварини. Найбільш сприятливими об`єктами, за деякими даними, є селезінка і лімфовузли щури, з яких вдається отримати нативні полірібосоми, седіментірующіе при 250-350S і 160-190S і активно включають пульсову аминокислотную мітку (Vassalli, 1967- Васильченко та ін., 1969). Є також повідомлення про виділення нативних полірібосом з селезінки кроликів (Becker, Rich, 1966- Scharff, Uhr, 1965) і морських свинок (Миколаєва, 1976). З пухлинних тканин найбільш багатим джерелом полірібосом є міеломи- в лімфомах кількість цих органел менше (Sherr, Uhr, 1971a).

В результаті удосконалення техніки фракціонування з лімфоїдних тканин тварин і клітин мишачих плазмоцидом вдалося виділити широкий спектр полірібосом з константами седиментації від 118S до 350S. Було показано, що при імунізації кількість полірібосом в півтора-два рази зростає (Moav, Harris, 1970 Юрін, 1971), а розподіл їх набуває специфічного біфазної характер. Аналогічні дані на клітинах мієлом були отримані Шубертом (Schubert, 1968) і нами (Сидорова та ін., 1973).

Виникло припущення, що біфазної розподіл полірібосом, мічених по зростаючим поліпептидним ланцюгах, відображає наявність двох класів полірібосом, що беруть участь в синтезі Н і L-ланцюгів. Дослідами з іммунопреціпітація полірібосом антисироватками до Н і L-ланцюгів дійсно було показано, що Н-ланцюги виявляються тільки на полірібосомамі 270-300S, а L-ланцюга - переважно на полірібосомамі 180-190S (Shapiro ea, 1966a- Askonas, Williamson, 1967b ). Відповідно до проведених авторами розрахунками, такі полірібосоми повинні були містити мРНК, що складаються приблизно з 1250 і 500 нуклеотидів, т. Е. Цілком придатні для кодування синтезу Н-та L-ланцюгів.

Отримані дані дозволили зробити два принципово важливих висновки, а саме: 1) синтез імуноглобулінів носить моноцістронниі характер і 2) розміри полірібосом і мРНК, що беруть участь в утворенні Н-і L-ланцюгів, цілком достатні для кодування синтезу кожної з них як єдиного цілого.