Терапія-вплив генів, що відповідають за синтез кардіальних білків актину і дистрофина, на розвиток хронічної серцевої недостатності у хворих з інфарктом міокардаі дилатаційною кардіоміопатією

Для розуміння механізмів розвитку і прогресування хроніческойсердечной недостатності (ХСН) наукові дослідження последніхлет зосереджуються на оцінці вкладу генетичних факторів вразвітіі недостатності кровообігу. Це є перспектівнимподходом в зв`язку з тим, що виявляється генетичний ризик і проісходітпрогнозірованіе ускладнень захворювання до появи їх клініческіхпроявленій [1, 2]. Так, в даний час на молекулярному уровнерассматрівается патогенез кардіоміопатій, оскільки проісходітнарушеніе в процесі експресії генів, зокрема механізмовпретрансляціі, трансляції і посттрансляціі, що веде до ізмененіюфенотіпа [2]. Відомі роботи по виявленню генетичних факторовразвітія ХСН у хворих з дилатаційною кардіоміопатією (ДКМП), зокрема у цих хворих виявлялися мутації в різних участкахгенов, що відповідають за синтез білків дистрофина і актину [3, 4,5, 6].
В літературі відсутні повідомлення про мутаціігена дистрофина і актину у хворих з інфарктом міокарда, хотяможно припустити, що аналогічна мутація можлива під вліяніемстресса і активації нейрогуморальних механізмів.
У зв`язку з цим метою роботи стало ісследованіегенов актину і дистрофина і у хворих з ідіопатичною ДКМП, иу осіб, які перенесли інфаркт міокарда.

матеріали та методи

У ісследованіевключено 130 хворих, з них 104 чоловіків і 26 жінок, в возрастеот 21 до 88 років. Хворі були розділені на три групи: 1-я група-хворі на гострий крупновогнищевим і трансмуральний інфаркт міокарда, ускладнені ХСН II - IV ФК за NYHA, 2-я група - з інфарктом міокардабез клінічних ознак серцевої недостатності, 3-я група-хворі ідіопатичною ДКМП з ХСН II - IV ФК. Групу контролясоставіло 30 осіб, з них 21 чоловіків і 9 жінок, у возрастеот 25 до 76 років (середній вік 55,5 років) без серцево-сосудістойпатологіі і не мають важких хронічних захворювань.
Клініко-демографічна характеристика больнихпредставлена в таблиці.
Дослідження генів актину і дистрофина проізводілосьв Інституті загальної генетики, в лабораторії екологічної та радіаціоннойгенетікі Інституту біології гена РАН.
Для виділення ДНК була використана цельнаякровь, взята в пробірку з ЕДТА з кінцевої концентрацією 50mMілі цитратом з кінцевої концентрацією 0,5%. Виділення ДНК проводіліс використанням набору реагентів "DiatomTMDNA Prep 200" (фірма "Biokom"). В основі виділення ДНК за допомогою даного наборалежіт використання лізуючого реагенту з гуанідінтіоціонатомі сорбенту ДНК "Nucleos". У присутності високих концентрацій гуанідінтіоціоната (4M) ДНК активно сорбується на поверхні частинок "Nucleos", а інші компоненти крові залишаються в середовищі, які потім удаляютсяцентріфугірованіем. ДНК, промита спіртосолевим буфером, затемсмивается з сорбенту Екстрагенние, сумішшю ионообменников і напрямуюіспользуется для постановки полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) .Виделенія ДНК з цільної крові проведені відповідно до інструкціейіспользованного набору "DiatomTMDNA Prep 200" фірми "Biokom".
Для виявлення мутації в гені кардіоактінаіспользовалі метод PCR-RFLP, згідно з яким продукт ПЛР режетсясоответствующей рестриктазой, дізнатися цікаву точкову нуклеотіднуюзамену. Рестріктаза Bcl I з сайтом рестрикції (-TGATCA-) виявляетміссенс мутацію G (норма) на А (мутація) в 5-лс екзоні гена кардіоактіна, пов`язана з ідіопатичною дилатаційною кардіоміопатією. Сінтезпраймеров для дослідження 5-м екзонів кардіоактіна був проведена синтезаторі PE Applied Biosystems (США). Склад праймерів: F 5 / -gactcgttcccaggtatg R 5 / -gatctcccactcacaaaag.
Постановку ПЛР проводили в наступному режімеампліфікаціі: 950С - 40 с, 580С - 30 с, 740С - 40 з по 30 циклів.
Розмір амплифицированного фрагмента 222 паринуклеотідов. Кінцеві концентрації реакційної суміші ПЛР: 67 mMТріс Hcl c pH = 8,8, 16 mM (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>, 0,01% Tween 20,1 од. Taq.полімерази, 200mM dNTP кожного, 0,5 mM праймерів кожного 10-20ng ДНК досліджуваної, 1,5 mM MgCl<sub>2</sub>,кінцевий обсяг PCR суміші 30 мкл.
Для аналізу результатів ампліфікації 10 мклПЦР продукту наносили на 2% агарозному гель-електрофорез. ДНК вгеле проявляли з бромистим етидієм в УФ-світлі довжиною хвилі 32нм. Після візуальної оцінки концентрації PCR продукту определяліоб`ем PCR суміші, необхідної для постановки реакції рестрикції (від 5 до 10 мкл PCR суміші).

Дослідження гена дистрофина

Для обнаруженіямутаціі в гені дистрофина використовували метод ПЛР з сіквенсспеціфіческіміпраймерамі (PCR-SSP), згідно з яким для проведення ПЛР іспользуетсяпара праймерів, один з яких містить одну або дві точечниезамени. Одна з замін є цікаву точечнуюнуклеотідную заміну. Принцип методу полягає в тому, що пріоптімальной температурі отжигаются праймери при відсутності мутацій з`являєтьсяспецифічна смуга ПЛР продукту, а в разі мутацііпрі тієї ж температурі праймери НЕ отжигаются і реакція ампліфікацііне проходить. Вибрані дві пари сіквенсспеціфіческіх праймеровпредназначени для виявлення міссенс мутації A на G в 9-м екзонегена дистрофина нормальної послідовності і з мутацією, соответственносвязанная з Х-зчепленої ідіопатичною ДКМП.
Синтез праймерів для дослідження 5-го екзонакардіоактіна був проведений на синтезаторі PE Applied Biosystems (США).
Склад праймерів: Dn 5-gta aat gtt gac aga cctgtg 5-gaa cct ctc tcg cag atc acg Dm 5-gta aat gtt gac aga cctgtg 5-gga tcc tct ctc gca gat cgc a
Постановку ПЛР проводили в наступному режімеампліфікаціі: 950С - 40 с, 560С - 30 с, 740С - 40 з по 35 циклів.
Розмір амплифицированного фрагмента 160 парнуклеотідов. Кінцеві концентрації реакційної суміші ПЛР: 67 mMТріс Hcl c pH = 8,8- 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 од. Taq полімерази, 200mM dNTP кожного, 0,5 mM праймерів кожного 10-20ng ДНК досліджуваної, 1,5 mM MgCl₂,кінцевий обсяг ПЛР суміші 30 мкл.
Таблиця. Клініко-демографічна характеристика хворих.

Для аналізу результатовампліфікаціі 10 мкл ПЛР продукту наносили на 2,5% агарозному гель-електрофорез.ДНК в гелі проявляли з бромистим етидієм в УФ-світлі довжиною волни320 нм.
Для виявлення точковой мутації в ісследуемихпробах реєструють наявність або відсутність ампліфіцірованногофрагмента з відповідною парою праймерів:
1. Наявність ПЛР фрагмента довжиною в 160 пар нуклеотідовпрі ампліфікації з парою праймерів для нормальної последовательностіуказивает на норму.
2. Відсутність ПЛР фрагмента довжиною в 160 парнуклеотідов при ампліфікації з парою праймерів для нормальнойпоследовательності вказує на наявність передбачуваної мутації.
3. Наявність ПЛР фрагмента довжиною в 160 пар нуклеотідовпрі ампліфікації з парою праймерів для послідовності з мутаціейподтверждает наявність мутації.

Результати та їх обговорення

Як вказувалося, в літературі відсутні повідомлення про мутації гена дистрофина іактіна у хворих з ішемічною хворобою серця, зокрема сінфарктом міокарда, хоча під впливом нейрогормонов та інших біологічно активних речовин, які активізуються у відповідь на поврежденіесердечной м`язи (в даному випадку при інфаркті міокарда), возможнопредположіть аналогічну мутацію. Однак, незважаючи на правільниетеоретіческіе передумови і наші очікування, мутації цих генів досліджуваних хворих виявлено не було. Більш того, не определяласьмутація і в групі хворих з ДКМП, хоча в останні роки в результатеряда досліджень отримані досить значущі результати, коториекасаются зв`язку мутації генів дистрофина і актину із серцевою недостаточностью.В зокрема, R. Ortiz-Lopez і співавт. [2] досліджували геномнуюДНК в 3 неспоріднених сім`ях з Х-зчепленої дилатаційною кардіоміопатією.Група контролю включала 50 осіб жіночої та 50 чоловічої статі, неє родичами. Для ампліфікації ДНК використовували ПЦР.В результаті дослідження в одній із сімей з Х-зчепленої ДКМПбила виявлена мутація гена, що кодує дистрофин, локалізующегосяв 21-й хромосомі, зокрема знайдена заміна аденіну на гуанінв екзоні 9 в позиції 1043, що призвело до синтезу гидрофобной неполярнойамінокіслоти аланина замість гідрофільного полярного треоніну, що знаходиться в дистрофина в позиції 279, що відноситься До n-кінця білка дистрофина. Заміна треоніну на аланін веде до ізмененіюполярності N-кінця білка і, отже, до зміни вторічнойі третинної структури дистрофина. Таким чином, дана мутаціяявляется причиною втрати мембраностабилизирующей функції етогобелка і порушення функціональної активності кардіоміоцитів, щоі призводить до Х-зчеплення дегенеративного захворювання міокарда- Х-зчепленої ДКМП.
F. Muntoni і співавт. [4], а також J. Milasinі співавт. [5] описували мутації в інших ділянках гена дістрофіна.Еті ділянки були досліджені R. Ortiz-Lopes і співавт. [3] в техже 3 сім`ях з Х-зчепленої ДКМП, мутації в цих ділянках виявленоне було. Отже, можна думати про різні механізми, ведущіхк розвитку дістрофінопатій.
Таким чином, будь-яка мутація гена дістрофінапріводіт до дефіциту цього миокардиального білка, що являетсяпрічіной відсутності в міокарді дістрофінассоціірованних гликопротеидов [7, 8], що відповідають за зв`язування мультіпротеінного комплексу сбелкамі екстрацелюлярного матриксу. Результатом цього являетсядезорганізація кардіоміоцитів, що веде до зміни механіческоймоделі міокарда, порушення його насосної функції і ХСН.
Що стосується мутації кардіального актину, тов 1998 р опублікована робота T. Оlson і співавт. [6], продемонструвала дослідження двох не споріднені семейс аутосомно-домінантною ідіопатичною кардіоміопатією (одна семьянемецкого походження, друга - шведсько-норвезької). Для всехчленов проводилися дослідження ехокардіографії, біопсіяміокарда, яка виявила характерні для ДКМП ознаки (фокальний інтерстіціальнийфіброз і гіпертрофію кардіоміоцитів). Для виявлення мутацій гені актину використовувалася ПЦР. Виявлено дві одиночні мутацііетого гена: одна - в 5-м екзоні гена кардіоактіна (заміна гуанінана аденін, що призводить до кодування синтезу гистидина в 312-мположеніі замість аргініну), інша - в 6-м екзоні (заміна аденінана гуанін, наслідком чого з`явився синтез в 361-му положенні гліцінавместо глутаміну). Але можна було б ці заміни розглядати врамках поліморфізму гена кардіоактіна. Для виключення такого предположеніяпротестіровани 435 нерідних людей, описаної мутації виявленоу них не було. Отже, зазначені варіанти гена актину ассоцііруютсяіменно з ідіопатичною ДКМП.
Те, що в нашій роботі не виявлялася мутаціягенов актину і дистрофина, не є прямим твердженням того, що мутації дійсно немає. Можливо, мутація відбувається вбол пізні терміни захворювання? Слід зазначити, що в нашемісследованіі не проводилося генетичного аналізу в сім`ях з ідіопатіческойДКМП, а були взяті неспоріднені люди. Ймовірно, для глубокіхвиводов необхідно також велике в популяційному плані ісследованіе.І, може, не менш значущим було б дослідження генів другіхструктурних компонентів серцевого м`яза, зокрема коллагенаі еластину, мутація яких, можливо, теж має значення в развітііХСН.

література:
1. Tерещенко С. Н. Клініко-патогенетичні генетичні аспекти хронічної серцевої недостатності і можливостей медикаментозної корекції. / Дисс. ... Д-ра. мед. наук.- М. 1998- 287.
2. Bristow M.R. Why does the myocardium fail? Insights from basic science. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ortiz-Lopez R., Li H., Su J., Goytia V., Towbin J.A. Evidence for a dystrophin missensemutation as a cause of X-linked dilated cardiomyopathy. // Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F., Cau M., Ganau A., Congiu R., Arvedi G., Mateddu A., Marrosu M.G., Cianchetti C., Realdi G., Cao A., Melis M.A. Brief report: deletion of the dystrophin muscle-promoterregion associated with X-linked dilated cardiomyopathy. // N.Engl. J. Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasin J., Muntoni F., Severini GM, BartoloniL., Vatta M., Kraoinovic M., Mateddu A., Angelini C., CameriniF., Falaschi A., Mestroni L., Giacca M. and HMD Study Group . Apoint mutation in the 5 `splice site of the dystrophin gene firstintron responsible for X-linked dilated cardiomyopathy.// Hum.Mol. Genet. 1996- 5: 73-9.
6. Olson T.M., Michels V.V., Thibodeau S.N., Tai Y.S., Keating M.T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. // Science. 1998- 280: 750-2.
7. Bies R.D., Maeda M., Roberds S.L., HolderE., Bohlmeyer T., Young J.B., Campbell K.P. A 5 `dystrophin duplicationmutation causes membrane deficiency of alpha-dystroglycan in afamily with X-linked cardiomyopathy. // J. Mol. Cell. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Franz W.M., Cremer M., Herrmann R., GrunigE., Fogel W., Scheffold T., Goebel H.H., Kircheisen R., KublerW., Voit T. et al. X-linked dilated cardiomyopathy. Novel mutationof the dystrophin gene. // Ann NY Acad. Sci. 1995- 752: 470-91.